5. CAPÍTULO 2 Campylobacter jejuni e Campylobacter coli em carcaças de frango
2.3 Extração de DNA e Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR)
A extração de DNA das amostras e a análise por multiplex-PCR foram realizadas conforme Borsoi et al. (2009). Brevemente, as amostras foram centrifugadas a 12.000 rpm por 10 minutos e o sobrenadante descartado. O pellet obtido foi suspenso em 800 μL de água ultrapura, homogeneizado e novamente centrifugado a 12.000 rpm por cinco minutos. Este procedimento foi realizado quatro vezes e o material ressuspenso em 200 μL de água ultrapura. Em seguida, as amostras foram colocadas em bloco térmico entre 96ºC e 98ºC por 10 minutos, centrifugadas a 12.000 rpm por 10 minutos e o sobrenadante armazenado para as análises por multiplex-PCR.
Utilizou-se o multiplex-PCR proposto por Denis et al. (1999) adaptado por Perdoncini et al. (2015) para diferenciar C. jejuni e C. coli, com três pares de primers para cada reação, baseados na sequência para região 16rRNA comum entre as espécies, como segue: MD16S1 (5'-ATC TAA TGG CTT AAC CAT TAA AC - 3') e MD16S2 (5' -GGA CGG TAA CTA GTT TAG TAT T - 3'), com 857pb. A identificação das espécies C. jejuni e C. coli foram baseadas no gene mapA e ceuE, respectivamente, com a sequência de primers MDmapA1 (5' -CTA TTT TAT TTT TGA GTG CTT GTG - 3') e MDmapA2 (5'-GCT TTA TTT GCC ATT TGT TTT ATT A - 3') para o gene mapA e COL3 (5' -AAT TGA AAA TTG CTC CAA CTA TG - 3') e MDCOL2 (5' -TGA TTT TAT TAT TTG TAG CAG CG-3') para o gene ceuE.
As reações ocorreram em termociclador (Biocycler-Peltier Thermal Cycler) com desnaturação inicial de 95 ºC por 10 minutos; 35 ciclos a 95 ºC por 30 segundos; anelamento a 59 ºC por 1 minuto e 30 segundos; extensão a 72 ºC por 1 minuto e extensão final a 72 ºC por 10 minutos. A eletroforese dos amplicons foi realizada em gel de agarose a 1,5% (Invitrogen), corado com brometo de etídio e visualizado em sistema de foto documentação com transluminador ultravioleta (UV) (ATTO®).
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Das 36 amostras de carcaças resfriadas e congeladas foi verificada positividade para
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Tabela 1. Ocorrência de Campylobacter jejuni e/ou C. coli em carcaças de frango resfriadas e congeladas coletadas em abatedouros avícolas.
Abatedouro Carcaças Resfriadas (%) Carcaças Congeladas (%) Total (%) A 33,3% 0% 16,66% B 100% 66,6% 83,33% C 83,3% 100% 91,7% TOTAL 72,2% 55,5% 63,8%
Neste trabalho, a ocorrência de Campylobacter termotolerantes em carcaças resfriadas foi 72% e para carcaças congeladas 55%. Os resultados deste trabalho são superiores aos citados por Mulinari et al. (2014), que identificou Campylobacter em 43,2% carcaças de frangos e em 7,7% dos miúdos e cortes avaliados.
Concordando com este estudo, Franco et al. (2004) citam que C. jejuni sobrevive em ambientes e alimentos refrigerados melhor do que em temperatura ambiente, contrariando as características tradicionais de outras bactérias. Neste sentido, Maziero e Oliveira (2010), ao analisar carne de frango após a embalagem no frigorífico, 4 dias a 4°C e 28 dias a 20°C negativos, citam que houve diferença significativa em UFC/g de Campylobacter spp. entre amostras frescas e armazenadas sob refrigeração ou congelamento, indicando que a bactéria pode sobreviver bem ao período de comercialização de carnes resfriadas.
Estes resultados estão em concordância também com Bhaduri e Cottrell (2004) que, ao avaliarem a sobrevivência de C. jejuni a 4°C e -20°C em carne de frango, artificialmente contaminadas e irradiadas, concluíram que a refrigeração reduziu as contagens da bactéria após 3 e 7 dias, mas células viáveis ainda podiam ser detectadas após 14 dias de estocagem.
Dados do FDA (2011) revelam uma variação entre 30 e 100% das aves que carreiam este microrganismo e de 20 a 100% de contaminação nos produtos do varejo. Esta variação é confirmada por Medeiros et al. (2012), que ao avaliar 30 carcaças de frango resfriadas identificaram Campylobacter spp. em 21 amostras (70%), sendo 28,6% em abatedouros, 38,1% em supermercados e 7, 33% em feiras livres.
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A sobrevivência de Campylobacter em amostras resfriadas é citada por Azeredo et al. (2010), que avaliou carcaças de frango após o resfriamento e constatou que Campylobacter spp. manteve-se viável a 4ºC; Badaró (2013), ao citar 44 % de positividade em carcaças de frango provenientes de abatedouros do Estado de Minas Gerais; Oliveira e Oliveira (2013) com 20% de positividade em carcaças na saída do chiller e Maziero (2007), com a detecção de Campylobacter termotolerantes em 53,3% em amostras de carne de frango resfriadas e 36,67% em amostras congeladas.
Já a sobrevivência de Campylobacter em amostras congeladas é relatada por Lee et al., (1998), que citam que Campylobacter pode ser inativado em temperaturas a partir de 15ºC negativos. Entretanto, para os autores o congelamento não eliminaria o patógeno em alimentos previamente contaminados.
Além da ocorrência de Campylobacter nas carcaças de frango avaliadas no presente estudo destaca-se a identificação de espécies termotolerantes associadas as DTAs, com 44,4% (16/36) de C. jejuni, 36% (13/36) de C. coli e 16,7% (6/36) para ambas. A prevalência destas espécies é citada também por Perdoncini et al., (2015), que identificaram Campylobacter
jejuni e/ou C. coli em 37,1% de 105 carcaças resfriadas. As carcaças avaliadas eram oriundas
de cinco matadouros-frigoríficos do estado do Rio Grande do Sul, com ocorrência entre zero e 71,4%
Sierra Argüello et al. (2015) citam a presença de Campylobacter jejuni em 140 amostras (99,2%) e Campylobacter coli em uma amostra (0,7%) ao avaliar fezes (n=8), água do chiller (n=18), carcaças de frango (n=26) e carne de frango pronta para o consumo (n=89) oriundas de abatedouros de aves também neste Estado. Já Hue et al. (2011) demostraram 57,1% de C.
jejuni e 42,5% de C. coli em 532 carcaças de frango avaliadas.
A contaminação cruzada devido à manipulação inadequada de alimentos no ambiente doméstico é considerada uma fonte importante de infecção (MATTICK et al., 2003). A positividade encontrada nesse estudo e os resultados demonstrados por outros autores, evidenciando a contaminação por Campylobacter nos produtos avícolas é preocupante, visto que a dose infectante para Campylobacter é baixa. Além disto, as espécies identificadas são termotolerantes, e consequentemente passíveis de causar DTAs. Por tratar-se de um produto resfriado e/ou congelado, onde microrganismos deste gênero podem sobreviver às condições de armazenamento, deve-se induzir a prevenção das infecções por Campylobacter com instruções adequadas ao consumidor final, bem como a aplicação das Boas Práticas de Fabricação e a indicação de cozimento adequado a estes produtos.
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4. CONCLUSÃO
Verificou-se a presença de cepas termotolerantes de Campylobacter em 63,8% das carcaças de aves congeladas e resfriadas avaliadas, indicando estes produtos finais como prováveis fontes de transmissão de Campylobacter para humanos.
AGRADECIMENTO
Ao apoio financeiro da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul (FAPERGS, Programa Pesquisador Gaúcho - PqG – Edital FAPERGS nº 004/2012).
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6. CONCLUSÕES
O número crescente e a gravidade de doenças transmitidas por alimentos em todo o mundo têm aumentado consideravelmente. Bactérias do gênero Campylobacter spp. são reconhecidas como importantes patógenos de origem alimentar e agentes de enterites em humanos, com as espécies termofílicas Campylobacter jejuni e C. coli especialmente notificadas nos surtos de campilobacteriose em humanos e as aves consideradas dentre as principais fontes de infecção. Conforme os resultados deste estudo concluiu-se que:
a) Campylobacter spp. foi identificado em todos os pontos de coleta nos abatedouros de frangos de corte avaliados, mantendo-se viável até os produtos finais e com maior ocorrência em carcaças resfriadas e congeladas;
b) Campylobacter spp. foi isolado nas gaiolas de transporte das aves mesmo após a higienização das mesmas, evidenciando a ineficiência do procedimento utilizado nos abatedouros avaliados;
c) As espécies termofílicas Campylobacter jejuni e C. coli foram identificadas em carcaças resfriadas e congeladas, evidenciando a capacidade de sobrevivência destes agentes a estas condições de armazenagem.
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7. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Doenças transmitidas por alimentos (DTAs) constituem uma preocupação mundial em saúde pública, sendo que nas últimas décadas o aumento de sua ocorrência pode ser observado em várias partes do mundo. Campylobacter spp. vem se destacando dentre as principais causas bacterianas de DTAs em diversos países, que associam a maioria dos surtos ao consumo ou manuseio incorreto de carne de frango contaminada. No Brasil há poucas informações oficiais sobre a ocorrência de campilobacteriose de origem alimentar ou dados de prevalência de Campylobacter spp. em abatedouros de frangos de corte.
Neste contexto, um dos objetivos deste estudo, que era avaliar a contaminação por
Campylobacter spp. em diferentes pontos da tecnologia de abate de frangos de corte por
microbiologia convencional, foi plenamente alcançado. No transcorrer do projeto também foi possível identificar as espécies termotolerantes Campylobacter jejuni e C. coli por Multiplex – PCR, caracterizando as amostras de carcaças resfriadas e congeladas como potencialmente capazes de causar DTAs.
A quantificação de Campylobacter spp. nos diferentes elos da cadeia produtiva de aves e no monitoramento dos riscos microbiológicos desde as granjas até as carcaças resfriadas ou congeladas pode ser uma ferramenta útil para direcionar ações que resultem na redução deste patógeno nos produtos avícolas e consequentemente nos riscos para o consumidor final. Neste cenário, a quantificação por PCR em tempo real será realizada assim que possível e os dados gerados publicados em revistas da área de estudo.
E ainda, considerando o alto consumo da carne de frango, será realizado um novo estudo, visando a detecção e quantificação deste agente em amostras de varejo, como cortes congelados e resfriados, a fim de fornecer dados sobre a contaminação por Campylobacter spp. e termofílicos em produtos prontos para o consumo humano. Mesmo que estes produtos não sejam consumidos crus, existe uma preocupação visto que a contaminação cruzada contribui para o surgimento das DTAs.
Por fim, em função destes produtos serem destinados diariamente a milhões de consumidores, ressalta-se a importância do estabelecimento de programas nacionais de
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