Espinhos dorsais, pélvicos e caudais envolvidos com tecido circundante de (5-6) peixes-escorpião S. plumieri foram excisados e imediatamente triturados e moídos na presença de nitrogênio líquido até que o material formasse um pó fino. O material resultante foi armazenado na presença de nitrogênio líquido até o início dos protocolos de extração de RNAs descritos a seguir.
2.3.1. Preparação de RNA total dos espinhos de S. plumieri
O RNA total foi isolado dos espinhos dorsais, pélvicos e caudais utilizando uma solução caotrópica de isotiocianato de guanidina (GITC), segundo a técnica descrita por CHOMCZYNSKI e SACCHI (1987) com algumas modificações.
Nessa técnica, para cada 100 mg de tecido (após triturar) foram adicionados 1 mL de solução ácida desnaturante formada com a concentração final dos seguintes reagentes: isotiocianato de guanidina 4 M, citrato de sódio 25 mM, sarkosyl 0,5% (p/v) e 2-β-mercaptoetanol 0,1 M, pH 4,0. O tecido e a solução desnaturante foram homogeinizados por 30 s com auxílio de homogeinizador de vidro Teflon.
O homogenato resultante foi transferido para tubos de centrífuga de polipropileno estéreis e incubados por 15 min no gelo, após a adição sequencial de 0,1 mL de acetato de sódio, 3M, pH 4,0, 1 mL de fenol saturado em água e 0,2 mL da mistura clorofórmio:álcool isoamílico (49:1). Após adição de cada solução, o homogenato foi misturado minuciosamente por inversão e os tubos foram mantidos no gelo durante todos os passos.
A mistura resultante foi centrifugada a 10.000 X g por 20 min a 4°C e o sobrenadante límpido foi cuidadosamente coletado e transferido para novos tubos de centrífuga livres de RNases. As amostras foram então precipitadas com igual adição de isopropanol 100% (v/v) durante 12 h a -20°C. Após a precipitação do RNA total, os tubos foram centrifugados a 4°C, 10.000 X g por 30 min, o sobrenadante foi cuidadosamente descartado e os precipitados foram ressuspendidos com 0,3 mL de solução desnaturante e transferidos para tubos de Eppendorf 1,5-mL livres de RNases.
As amostras foram novamente precipitadas com adição de 0,3 mL de isopropanol 100% (v/v) durante 12 h a -20°C e, depois centrifugadas a 4°C, 10.000 X g por 30 min. Em seguida, os pellets foram lavados (3 X) com solução de etanol 75% (v/v), vortexados e incubados por 15 min à temperatura ambiente, para dissolver resíduos de guanidina que contaminam o pellet. Após cada etapa de lavagem com etanol, os tubos de microcentrífuga contendo RNA foram centrifugados a 14.000 rpm e 4°C por 10 min e o sobrenadante foi descartado.
Os pellets de RNA total foram secos em centrifugação à vácuo por 3-5 min e, por fim, as amostras foram ressuspendidas em 50 L de H2O DEPC. Alíquotas foram
separadas e armazenadas a -80°C, até o momento do uso.
2.3.2. Isolamento de RNA mensageiro das preparações de RNA total de S.
plumieri
Poli(A)+ RNA foi separado do RNA total por cromatografia líquida de afinidade utilizando resina de oligo(dT) celulose e seguindo as recomendações do fornecedor, com algumas adaptações (Messenger RNA Isolation Kit, Stratagene).
Para a realização desse procedimento, inicialmente 2,5 mL de resina oligo(dT)cellulose (0,04 g/mL) foram empacotadas em uma seringa estéril com lã de sílica na extremidade inferior. A coluna foi equilibrada com 25 mL de tampão de eluição (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM), mantendo um fluxo constante de ~ 1 gota a cada 2 s.
Antes da purificação, as amostras de RNA total foram aquecidas por 10 min a 65°C e depois colocadas no gelo. Em seguida, amostras contendo aproximadamente 0,1-0,15 mg (< 400 L) de RNA foram aplicadas na coluna e tubos de microcentrífuga- 1,5 mL estéreis foram utilizados para recuperar o eluído. As amostras de RNA total foram então reaplicadas na coluna por 2 X para garantir que a maior parte das moléculas poliadeniladas liguassem na resina.
Prosseguindo, foram aplicados sequencialmente na coluna: 2 X de 200 L de tampão com alta concentração de sal (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM, NaCl 0,5 M) e 3 X de 200 L de tampão com baixa concentração de sal (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5,
EDTA 1 mM, NaCl 0,1 M). Em seguida, o RNA mensageiro foi eluído utilizando quatro alíquotas de tampão de eluição (400 L) pré-aquecidos a 65°C e, por fim, o eluato foi recuperado e imediatamente preparado para precipitação.
Para cada amostra de mRNA foram adicionados: 40 L de acetato de sódio 3M, 1 L de glicogênio (20 mg/mL) e 1,1 mL de etanol 100% (v/v). Cada tubo foi vortexado e a precipitação do mRNA foi realizada durante 12 h a -20°C.
As amostras foram centrifugadas a 14.000 rpm e 4°C por 30 min e o sobrenadante foi descartado. Em seguida, os pellets de mRNA foram secos por centrifugação a vácuo por 5 min e, por fim, as amostras foram armazenadas a -80°C, até o momento do uso. Alíquotas para experimentos imediatos foram feitas com adição de 20 L de H2O DEPC e aquecimento a 65°C por 5 min para garantir que os
mRNA fossem completamente ressuspensos.
2.3.3. Dosagem de ácidos nucléicos
A quantificação de ácidos nucléicos (RNA total, mRNA, cDNAs e oligonucleotídeos de primers) foram realizadas em espectrofotômetro ®NanoDropND- 1000 com leituras em absorbâncias (A) de 260 e 280 nm. Foi considerado, para fator de conversão, segundo o protocolo descrito por Sambrook e Russell, 2001, que as densidades ópticas (D.O.) de 1,0 a 260 nm correspondem às concentrações de 40 g/mL, 50 g/mL e 33 g/mL para RNA, DNA dupla fita e DNA simples-fita, respectivamente. Os resultados das dosagens de RNA foram expressas em g/g tecido isolado do aparato peçonhento de S. plumieri.
As razões entre as leituras A260/A280 foram estimadas para verificar a pureza das
preparações das amostras. As amostras foram consideradas puras quando as razões apresentavam valores entre 1,8 e 2,0.
2.3.4. Eletroforese em gel de agarose (MOPS:formaldeído)
Para avaliar a integridade e estabilidade das moléculas de RNA total, as amostras foram submetidas à eletroforese em gel de agarose 1% (p/v) sob condições
desnaturantes na presença de tampão MOPS:formaldeído, segundo a técnica descrita por Sambrook e Russell, 2001.
Aproximadamente 0,5 g de agarose foram aquecidas com 42,5 mL de água DEPC e após resfriada a solução a 55°C, adicionou-se 5 mL de tampão MOPS 10 X, pH 7,0 (MOPS 200 mM, acetato de sódio 50 mM, EDTA 10 mM) e 2,7 mL de formaldeído 37% (v/v). Em seguida, misturou-se bem e rapidamente o gel foi transferido para o aparato de eletroforese até solidificar-se.
Para esta técnica, 2 g (v = 10 L) de RNA total foram inicialmente desnaturados por aquecimento a 65°C por 10 min e imediatamente refrigeradas no gelo por no mínimo 5 min antes de serem preparadas para o gel. Em seguida, para cada amostra foram adicionados 10 L de tampão loading [48% de formamida deionizada, 18% de formaldeído 37% (v/v) e 35% de tampão loading dye (160 L de tampão MOPS 10 X, 100 L H2O DEPC, 100 L de brometo de etídio 10 mg/mL, 80 L
de glicerol e 80 L de azul de bromofenol saturado em água)].
Para comparar a integridade dos perfis ribossomais e a distribuição da população das moléculas de RNA de S. plumieri, foram utilizados como padrões de peso molecular as preparações de RNA total isolado de fígado de Rattus norvegicus e tRNA isolado de E. coli.
Seguindo a preparação das amostras de RNA, elas foram aquecidas a 65°C por 5 min e aplicadas no gel solidificado imerso com tampão MOPS 1 X. A eletroforese foi carreada em um aparato horizontal com um fluxo de voltagem constante de 5 V/cm de gel, até o azul de bromofenol atingir ¾ do gel. Após a corrida, o gel foi lavado por 30 min em solução de sulfato de amônio 0,5 M para retirar o excesso de formaldeído e, em seguida, foi examinado com iluminação ultravioleta 312 nm (UV). Para documentação dos géis foi utilizado câmera fotográfica digital Canon Power Shot G11, 10 Mega Pixels.
A estabilidade do RNA total e verificação da presença de nucleases foram realizadas com incubação das amostras por 2 h a 37°C e, depois comparadas com amostras de RNAs não-incubadas e armazenadas a -80°C. A integridade do material foi confirmada em gel 1% (p/v) de agarose Mops:formaldeído, como descrito anteriormente.