Extrato etanólico da folha e da casca do caule de Lafoensia pacarí A St

As folhas e a casca do caule da planta medicinal L. pacarí foram coletadas no município de Urutaí (17º22’04,4”S; 48º12’19,6”W) pelo Msc. Bruno Leite Sampaio e pelo Prof. Dr. José Realino de Paula do Laboratório de Pesquisa em Produtos Naturais, Departamento de Farmácia/UFG. Posteriormente foram identificadas pelo Prof. Dr. Heleno D. Ferreira do Departamento de Biologia Geral/UFG, e uma exsicata foi depositada no herbário da Universidade Federal de Goiás, sob o número: 43.182.

As folhas e cascas do caule de L. pacarí foram desidratadas em estufa com circulação de ar, sob temperatura de 40ºC. Em seguida, o material foi pulverizado em moinho de facas com tamis número 100 (150μm) e o pó obtido, acondicionado em sacos plásticos, devidamente identificados e armazenados em local arejado e protegido da luz.

Para a obtenção do extrato etanólico, o pó da folha e da casca do caule foram macerados em etanol a 95%, o qual foi removido posteriormente com auxilio de um rotaevaporador. Após o processo de extração os extratos etanólicos de L. pacarí foram mantidos ao abrigo de luz, a uma temperatura de – 4ºC.

4.2 Teste de mutagenicidade de Ames

4.2.1 Cepas bacterianas

Foram utilizadas as cepas bacterianas de S. typhimurium TA98 e TA100. As linhagens utilizadas foram gentilmente cedidas pelo Laboratório de Radiobiologia Molecular do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brasil.

Foram utilizados Top-ágar; Solução de Cloreto de Sódio a 0,5%; Solução de Histidina / Biotina (0,5 mM); Caldo Nutriente; Meio Mínimo Glicosado (MMG) contendo solução de sais de Vogel-Bonner 50X (sulfato de magnésio heptahidratado, ácido cítrico monohidratado, fosfato de potássio dibásico, fosfato de sódio e amônio) e solução de dextrose (40%).

Antes de serem utilizadas, todas as soluções preparadas foram colocadas em autoclave a 120ºC durante 20 minutos.

Solução de sais de Vogel-Bonner

Sulfato de magnésio hidratado...1 g Ácido cítrico monohidratado P.A...10 g Fosfato de potássio dibásico P. A...50 g Fosfato de sódio e amônio P. A... 17,5 g Água morna destilada...65 mL

Solução de glicose 40%

Dextrose P. A...40 g Água destilada...100 mL

Ágar Mínimo Glicosado

Ágar...15 g Solução de sais de Vogel-Bonner...20 mL Solução de glicose 40%...50 mL Água destilada...930 mL

Para a preparação do Meio Mínimo Glicosado (placa-teste) foram distribuídos 30 mL do meio de cultura em placas de Petri. Posteriormente as placas contendo o ágar mínimo glicosado foram colocadas em repouso por 12 horas em estufa a 37ºC para posterior utilização.

Solução de Biotina (0, 5 mM)

Biotina...18 mg Água destilada...125 mL

Solução de Histidina (125 mL)

Histidina...50 mg Água destilada ...10 mL

Placa Máster

Ágar...7,5 g Solução de sais de Vogel-Bonner...10 mL Solução de glicose 40%...25 mL Solução de biotina...3 mL Solução de histidina...5 mL Água destilada... 500 mL Caldo Nutritivo Caldo nutritivo... ...5 g Água destilada... ...200 mL Solução Histidina/Biotina 0,5 mM D-Biotina...62 mg L-Hitidina...48 mg Água destilada...500 mL

Ágar de superfície com traços de biotina/histidina (top-ágar) Bacto

ágar...3 g Cloreto de sódio (NaCl)...2,5 g Solução de histidina/biotina...50 mL Água destilada...500 mL

4.2.3 Controles

Nos experimentos realizados foram utilizados controles positivos: 4- nitroquinolina (4NQO) para a cepa TA98 (0,5 µg), azida sódica para a cepa TA100 (1,5 µg). Como controle negativo utilizou-se água destilada esterilizada (100 µL) para

o extrato etanólico da folha. Já para o extrato etanólico da casca do caule de L.

pacarí o controle negativo utilizado foi água e dimetilsulfóxido (DMSO) na proporção

de 3:1 (100 µL).

4.2.4 Procedimento experimental: Teste de mutagenicidade de Ames

As cepas de S. typhimurium TA98 e TA100 foram inoculadas em caldo nutriente, a 37°C, com agitação constante por 12h até atingir a fase estacionária de crescimento.

Para avaliação da atividade mutagênica, alíquotas de culturas das cepas bacterianas (100 µL) foram incubadas em diferentes concentrações (0,5 mg, 1,0 mg, 2,0 mg e 4,0 mg) do extrato etanólico da folha e da casca do caule L. pacari em tubos de ensaio em triplicata com agitação e aeração constantes, durante 25 minutos. Também foram incluídos os controles positivos específicos para cada cepa (0,5 µg de 4-NQO para TA98 e 1,5 µg de azida sódica para TA100) e os controles negativos (100 µL de água destilada esterilizada para o extrato etanólico da folha e 100 µL de água e DMSO na proporção 3:1 para o extrato etanólico da casca do caule de L. pacarí). Após o período de incubação, foram adicionados 2 mL de ágar glicosado liquefeito (top-ágar), contendo a solução de histidina/biotina 0,5 mM, mantido à temperatura de 45ºC. A mistura foi homogeneizada e vertida em placas, em triplicatas, contendo meio mínimo glicosado, as quais foram incubadas a 37ºC durante 48h. Em seguida, foi feita a contagem do número de colônias revertentes por placa. Cada experimento constou de três repetições e foram realizados três experimentos para cada cepa.

Na avaliação da atividade antimutagênica, alíquotas de culturas das cepas bacterianas (100 µL) foram incubadas em diferentes concentrações (0,5mg, 1,0 mg, 2,0 mg e 4,0 mg) do extrato etanólico da folha e da casca do caule L. pacari concomitante aos controles positivos específicos para cada cepa (0,5 µg de 4-NQO para TA98 e 1,5 µg de azida sódica para TA100) em tubos de ensaio em triplicata com agitação e aeração constantes, durante 25 minutos. Também foram incubados os controles positivos 4 NQO e azida sódica. Após o período de incubação, foram adicionados 2 mL de ágar glicosado liquefeito (top-ágar), contendo a solução de histidina/biotina 0,5 mM, mantido à temperatura de 45ºC. A mistura foi homogeneizada e vertida em placas, em triplicatas, contendo meio mínimo

glicosado, as quais foram incubadas a 37ºC durante 48h. Em seguida foi feita a contagem do número de colônias revertentes por placa. Cada experimento constou de três repetições e foram realizados ao todo três experimentos para cada cepa.

4.2.5 Análise estatística dos resultados do teste Ames

Na avaliação da mutagenicidade, após a contagem do número de colônias revertentes foi calculada a razão de mutagenicidade (RM), dada pela seguinte equação:

Figura 17: Equação para calcular razão de mutagenicidade

O resultado é positivo para mutagenicidade quando o número de colônias revertentes nas placas for igual ou superior ao dobro do número de colônias revertentes espontâneas do controle negativo (MARON & AMES, 1983). Posteriormente todos os resultados foram submetidos à Análise de Variância (ANOVA), seguido do teste Tukey. Os valores de P < 0,05 foram considerados significativos quando comparados com o controle negativo.

Para a avaliação da antimutagenicidade foi calculada a porcentagem de inibição de mutagenicidade (PI). A porcentagem de inibição é dada pela equação presente na Figura 18:

RE: revertentes espontâneos PI: porcentagem de inibição

Figura 18: Equação para calcular porcentagem de inibição de mutagenicidade (Adaptado de SGHAIER et al., 2011).

Considera-se como resultado positivo quando a porcentagem de inibição é relevante, pelo menos acima de 30 % e para verificar significância estatística os resultados também foram submetidos a testes estatísticos, Análise de Variância (ANOVA), seguido do teste Tukey. Os valores de P < 0,05 foram considerados significativos quando comparados com o controle positivo.