F ATORES DE RISCO

Le milieu de culture était un milieu minéral (Table III-4) mimant la composition de la salive

des ruminants, adapté pour ne pas présenter d’autre source de carbone que la paille. Il est

constitué des solutions S1, S2, d’une source d’azote en large excès pour assurer la croissance

microbienne, de l’inhibiteur de méthanogenèse, d’une solution de vitamines (V7, Pfennig and

Trüper, 1992) et d’une solutions d’oligo-éléments (SL12, adaptée d’Overmann et al., 1992).

Ces deux dernières solutions ont été stérilisées par filtration (0,2 µm).

Table III-4 : Composition du milieu de culture

Solution mère Milieu

S1 (6,7X) (g/l) (g/l)

K2HPO4 1,3 0,195

S2 (6,7 X) (g/l) (g/l)

KH2PO4 3 0,45

NH4Cl 2,46 0,369

NaCl 6 0,9

MgCl2.6H2O 1,066 0,1599

CaCl2.2H2O 0,6 0,09

Source d’azote (g/l)

NH4Cl 5,4

Inhibiteur méthanogenèse mM

Bromoéthanesulfonate BrCH2CH2SO3Na 0,1 à 10

Solution V7 (4000x) (mg/l sol. mère) (mg/l)

Biotine C10H16N2O3S 8 0,002

p-aminobenzoate H2NC6H4CO2H 40 0,010

Thiamine C12H17ClN4OS · HCl 40 0,010

Pantothénate C18H32CaN2O10 20 0,005

Pyridoxamine C8H12N2O2 · 2HCl 200 0,050

VitamineB12 C63H88CoN14O14P 80 0,020

Nicotinate C6H5NO2 80 0,020

Solution SL12 (1000x) (mg/l sol. mère) (mg/l)

H3BO3 300 0,3

FeSO4.7H2O 1100 1,1

CoCl2.6H2O 190 0,19

MnCl2.4H2O 50 0,05

ZnCl2 42 0,042

NiCl2.6H2O 24 0,024

NaMoO4.2H2O 18 0,018

CuCl2.2H2O 2 0,002

Le ratio KH2PO4/ K2HPO4 de 2,3 permettait d’obtenir un milieu avec un pH initial de 6,15. Les

ratios C/N et C/P sont respectivement de 7 et 60 et permettent d’éviter toute carence, car ils

sont calculés sur la base d’une utilisation de la totalité du carbone exclusivement pour la

croissance bactérienne.

Le système de prélèvement utilisé est par ailleurs décrit en Annexe 2.

III.4.1. Cultures d’enrichissement

Pour les deux inocula, rumen ou termite, une première étape d’enrichissement a été effectuée

en cultures successives en batch (SBR – sequencing batch reactor) dans les conditions décrites

ci-avant. Pour chaque communauté microbienne testée, après décongélation lente à 4°C, un

premier réacteur a été inoculé avec soit 2% (m/v) de rumen bovin (à part égale de chaque

vache), soit 500 intestins de termite.

Pour la communauté issue de rumen bovin la paille de blé brute non-stérilisée (substrat A) a été

utilisée exclusivement, alors que pour le microbiote intestinal de termites deux conditions ont

été testées pour la stabilisation de la communauté : soit avec la paille brute non-stérile, soit la

même paille stérilisée (substrat A et substrat A stérilisé par autoclave).

Dans tous les cas, pour le rumen ou le microbiote de termites, le premier réacteur a été conduit

jusqu’à atteindre une concentration d’AGV stable, fixant ainsi le temps de culture de chaque

cycle d’enrichissement. Le cycle d’enrichissement suivant a été inoculé à partir de 10% (v/v)

du réacteur précédant. Cette procédure a été poursuivie jusqu’à obtenir une concentration

d’AGV finale stable sur au moins 3 cycles successifs. La Figure III-3 représente le principe de

la procédure d’enrichissement mise en œuvre.

Une fois la production d’AGV stabilisée, des échantillons de 200 mL de la communauté

enrichie ont été congelés à l’azote liquide et stockés à -80°C pour servir d’inoculum pour les

expériences suivantes, réalisées en cinétique fine et analysant le comportement dynamique des

communautés.

Les prélèvements réalisés lors des enrichissements concernaient les paramètres

macrocinétiques : production d’AGV et de gaz ainsi que dégradation du substrat en dynamique

et le suivi de la diversité microbienne aux points initiaux et finaux de chaque cycle.

Parallèlement à nos travaux d’enrichissement en bioréacteurs, un enrichissement du rumen en

communautés capables de dégrader la biomasse lignocellulosique a été effectué in vivo,

directement dans les vaches utilisées pour le prélèvement de rumen de cette étude (section

III.3.1). Pour cela, les rations alimentaires de ces animaux ont été progressivement enrichies en

paille de blé. Après trois mois, leur alimentation étant entièrement constituée de paille de blé,

un prélèvement ruminal a été effectué dans les mêmes conditions que décrit précédemment et

constituait la communauté enrichie in vivo. La dynamique de cet enrichissement in-vivo sera

ensuite comparée à celui de l’enrichissement rumen réalisé en bioréacteur.

III.4.2. Dynamique des communautés enrichies

Afin de caractériser la dynamique de dégradation de la lignocellulose par les communautés

rumen et termite enrichies, des cinétiques de fermentation ont été inoculées (10% v/v) à partir

des communautés enrichies (après décongélation lente à 4°C) et incubées pendant 15 jours dans

les mêmes conditions de culture décrites précédemment. Pour le rumen enrichi in vivo des

cinétiques de fermentation ont également été réalisées mais l’inoculation a été effectuée à 2%

(m/v). Des échantillonnages a minima quotidiens de phase liquide-solide et de phase gazeuse

ont été réalisés afin de pouvoir effectuer un suivi dynamique des composantes macrocinétiques,

enzymatiques et métaprotéomiques, ainsi que l’analyse de la diversité bactérienne (Thèse de L.

Auer) au cours de l’avancement de la réaction.

La caractérisation de la communauté issue de rumen bovin enrichie dans ces travaux a été

effectuée en triplicat ; les autres communautés enrichies issues de microbiotes intestinales de

III.4.3 Cultures sur des substrats prétraités

L’impact de l’utilisation de substrats prétraités a été évalué sur la communauté microbienne

enrichie issue de rumen bovin. Deux types de prétraitements ont été mis en œuvre :

chimio-mécaniques et enzymatiques.

III.4.3.1 Prétraitements physico-chimiques

Les fermentations sur les substrats prétraités chimio-mécaniquement (B, C et D) ont été

effectuées dans les mêmes conditions que pour le substrat brut (A) et en dupliquât de réacteurs.

La seule différence se situe dans le pH initial qui a été ramené à 6,15 par ajout de d’acide

phosphorique avant inoculation par la communauté microbienne évaluée.

III.4.3.2 Prétraitements enzymatiques

Les prétraitements enzymatiques de la paille ont été réalisés au laboratoire (détaillés

précédemment), directement avant leur évaluation en fermentation.

Les deux prétraitements enzymatiques étudiées en fermentation sont ceux traités avec i) une

xylanase (Xyn 11) produite par Thermobacillus Xylanolyticus fournie par le laboratoire

partenaire FARE (Reims – France) et ii) une cellulase commerciale Celluclast 1.5L

(Novozymes) à des concentrations respectives de 150U/g et 15 FPU/g. Par la suite, les

conditions de pH et température ont été ramenées à celles de la communauté issue de rumen

bovin (pH 6.15 et T 35°C) et la communauté microbienne a été inoculée à hauteur de 10% (v/v).

Les réacteurs de fermentation ont alors été menés dans les mêmes conditions que pour les

cinétiques évaluant cette communauté sur le substrat A (Section III.4.3.1.) pendant 15 jours.

Un plan d’échantillonnage a été mis en place afin d’atteindre les mêmes volumes (2,2 L) et

concentrations en substrat (20 gMS/L) que précédemment mis en œuvre au moment de

l’inoculation, tout en permettant l’analyse dynamique des prétraitements enzymatiques avant

inoculation.

Tous les prélèvements ont été effectuées a minima en tripliquat d’échantillonnage. Sauf

précision, ces techniques analytiques ont été mises en œuvre sur l’ensemble des échantillons

prélevés au cours des cinétiques fines, permettant l’analyse dynamique du comportement des

communautés microbiennes.

III.5.1. Caractérisation des substrats

III.5.1.1. Matières sèches, volatiles et minérales

Les matières sèches (MS), volatiles (MV) et minérales (MM) étaient évaluées sur des

prélèvements totaux de 10 mL. Les matières sèches étaient obtenues après séchage à 105°C

pendant 48h, et les matières minérales après calcination à 500°C pendant 2h. Les matières

volatiles constituaient alors la différence entre ces deux dernières. De plus le milieu minéral

étant volatil à 500°C (probablement lié à la charge en NH4Cl – formation de Cl2 gazeux), un

protocole de double rinçage à l’eau distillée (centrifugation de 10 minutes à 7197 xg) a été mis

en place pour déterminer au mieux les solides volatils selon les conditions décrites

précédemment.

III.5.1.2. Composition du substrat lignocellulosique

L’hydrolyse acide permettant la détermination de la composition du substrat lignocellulosique

était effectué sur des échantillons séchés (et non lavés) de 40 mg selon le protocole décrit par

de Souza et al. (2013). Brièvement, ces échantillons étaient hydrolysés dans des tubes en verre

en présence d’acide sulfurique concentré (0,5 mL à 10,8 M) pendant 1h à 30°C et sous agitation

douce de manière à déstructurer la matrice lignocellulosique. La concentration d’acide

sulfurique était ensuite ramenée à 1,5 M par ajout d’eau ultrapure (3,1 mL) et l’hydrolyse

poursuivie pendant 1h30 à 100°C. Les monomères ainsi générés étaient collectés dans la

fraction liquide par filtration sur fritté en fibre de verre. Le rétentat -constituant la fraction

ligneuse- était rincé abondamment à l’eau ultrapure (trois fois le volume) séché pendant 48h à

105°C puis calciné à 500°C (2h) pour détermination de la masse relative de lignine (m/m).

No documento Promoção da autogestão do regime terapêutico em pessoa com doença cardiovascular : construção de um procedimento de enfermagem (páginas 183-188)