Fase experimental in vivo

4.2.1 Animais

O estudo incluiu trinta e quatro ratos Wistar, machos, com idade de doze semanas e pesando de 300-350g, adquiridos do CEMIB-Unicamp (Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de Laboratório). Os animais foram acondicionados no biotério da Faculdade de Odontologia de Piracicaba (FOP-UNICAMP) e mantidos em gaiolas plásticas com acesso a comida e água ad libitum. Antes dos

Figura 3 – Desenho esquemático representando a fase experimental in vitro da determinação da concentração e tempo de fotoativação do corante.

procedimentos cirúrgicos, os animais passaram por um período de 5 dias para a aclimatação ao ambiente do laboratório a uma temperatura de 22ºC a 24ºC. Todos os procedimentos executados estavam de acordo com as normas éticas regidas pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA) e aprovados pela Comissão de Ética na Experimentação Animal (CEEA) - IBUNICAMP sob o protocolo de número 2727-1 (Anexo 1).

4.2.2 Delineamento do estudo

Dos trinta e quatro animais utilizados no experimento, trinta receberam, no

baseline, ligaduras em um dos primeiros molares inferiores para indução da periodontite

experimental. Os outros quatro animais não receberam ligadura e nenhum tipo de tratamento, sendo alocados no grupo controle negativo (CN). Todos os animais foram eutanasiados 14 dias após a indução da doença periodontal (Figura 4).

4.2.3 Indução da periodontite experimental

Os animais foram inicialmente pesados para o cálculo da correta dosagem do anestésico geral a ser administrada. Os animais foram anestesiados por meio da administração intramuscular de ketamina (1ml/kg) (Dopalen®; Vetbrands LTDA, Jacareí, SP, Brasil) e cloridrato de xylasina (0,3ml/kg) (Virbaxil®; Virbac do Brasil Indústria e Comércio LTDA, Roseira, SP, Brasil).

Após anestesia, os animais foram posicionados em aparato de Doku modificado (Doku, 1966) e os maxilares dos animais foram mantidos abertos por meio de bandas elásticas presas aos incisivos inferiores e a língua tracionada com o auxílio de um fio de algodão espesso. Em seguida, um espaçador endodôntico modificado foi introduzido entre o 1º e o 2º

Figura 4 – Delineamento do estudo.

Baseline

_{7 dias}

_{14 dias}

Indução da doença periodontal

Remoção das ligaduras e aplicação das terapias

molares inferiores, em um dos lados, escolhido por sorteio, para que fosse obtido um espaço entre os dentes para posterior inserção das ligaduras de algodão (fio de algodão nº 10, Coats Corrente, São Paulo, BR). As ligaduras foram colocadas no baseline, ao redor dos primeiros molares inferiores, de forma que ficassem posicionadas o mais subgengival possível, com o objetivo de favorecer o acúmulo de biofilme (Jonhson, 1975). Para fixação das ligaduras foram feitos três nós simples voltados para mesial.

4.2.4 Divisão dos grupos e aplicação das terapias

Sete dias após a indução da doença periodontal os animais foram anestesiados e dividos nos seguintes grupos:

• Doença periodontal (n = 8)

Os animais alocados nesse grupo, tiveram suas ligaduras removidas sete dias após a indução da doença periodontal e as mesmas foram coletadas e transferidas para microtubos de plástico (Eppendorf AG®_{, Hamburg, Alemanha) contendo 450µl de solução fluida}

reduzida de transporte (RTF) (Syed & Loesche, 1972) para análise microbiológica.

• RAR (n = 8)

Uma vez removidas as ligaduras dos dentes dos animais pertencentes a esse grupo, a RAR foi realizada com o auxílio de curetas manuais Gracey Mini-Five 11/12 e 13/14 (Hu-Friedy®_{, Chicago, IL, EUA), ao redor de todo o dente, de forma que todo depósito de}

biofilme e/ou cálculo fosse removido. As ligaduras desse grupo, após removidas, foram descartadas.

• RAR + TFD (n = 8)

Nos molares que receberam tratamento com RAR + TFD, inicialmente foi feito a aplicação da terapia fotodinâmica sobre a ligadura, no intuito de removê-las posteriormente para análise microbiológica. O seguinte protocolo foi adotado para realização da TFD:

Fotossensibilizador

Como determinado anteriormente o fotossensibilizador utilizado no estudo foi a curcumina/sacarose a 0,01%. Uma vez diluída a curcumina, a solução foi acondicionada em frascos âmbar envoltos em papel alumínio para que não sofressem influência da luz ambiente.

Fonte de luz

O equipamento utilizado nesse experimento como fonte de luz foi um aparelho tipo LED (Optilight Max, Gnatus®, Ribeirão Preto/SP, Brasil). O aparelho possuía uma ponta de fibra óptica que emitia luz azul com comprimento de onda de 450nm, potência de 310mW e poder de densidade de 122,04mW/cm2.

Nos dentes tratados com RAR + TFD, inicialmente com o auxílio de uma gaze, realizou-se um isolamento relativo na região lingual dos primeiros molares ligados a fim de que não houvesse escoamento do fotosensibilizador para o lado antagonista ou que o mesmo fosse deglutido pelo animal. Em seguida, 150µl da solução de curcumina a 0,01% foram aplicadas sobre a ligadura de forma que essa fosse totalmente embebida pelo corante. Aguardou-se um tempo de pré-irradiação de 1 minuto do produto e após esse período, a luz do LED foi incidida sobre a ligadura por mais 1 minuto para que ocorresse a fotoativação do fotosensibilizador. Em seguida a ligadura foi removida e colocada em microtubos contendo 450µl de RTF para análise microbiológica.

Após remoção da ligadura foi realizada a raspagem e alisamento radicular com o auxílio de curetas manuais Gracey Mini-Five 11/12 e 13/14 (Hu-Friedy®, Chicago, IL, EUA) e posteriormente foi realizada mais uma aplicação da terapia fotodinâmica primeiro com 1 minuto do corante no sulco gengival, seguida da irradiação da fibra de luz por mais 1 minuto.

• Curcumina (n = 6)

Nos dentes que receberam tratamento somente com curcumina, inicialmente realizou-se um isolamento relativo na região lingual dos primeiros molares ligados com uma gaze a fim de que não houvesse escoamento do fotosensibilizador para o lado antagonista ou que o mesmo fosse deglutido pelo animal. Em seguida, 150µl da solução de curcumina a 0,01% foram aplicadas sobre a ligadura de forma que essa fosse totalmente embebida pelo corante. Aguardou-se um tempo de ação de 1 minuto do produto e após esse período as

ligaduras foram removidas e colocadas em microtubos contendo 450µl de RTF para análise microbiológica. Após remoção da ligadura foi realizada uma nova aplicação da curcumina no interior do sulco gengival por 1 minuto e em seguida o excesso do corante foi removido com uma gaze.

4.2.5 Eutanásia dos animais

Sete dias após a realização dos tratamentos os animais que receberam tratamento e os pertencentes ao grupo CN foram submetidos à anestesia geral através de injeção intramuscular de 1ml/kg de ketamina (Dopalen®; Vetbrands LTDA, Jacareí, SP, Brazil) e 0,3 ml/kg de cloridrato de xylazina (Virbaxil®; Virbac do Brazil Indústria e Comércio LTDA, Roseira, SP, Brazil) e eutanasiados por decaptação. As mandíbulas foram removidas e separadas em sua sínfise e todo o tecido mole ao redor das hemimandíbulas foi retirado.