FASE EXPERIMENTAL

Após coleta de dados iniciais da ficha de dados sociodemográficos e da ficha clínica, cada paciente teve os sítios periodontais submetidos a um dos tratamentos descritos abaixo, conforme sorteio:

• Tratamento A (Grupo teste):

Orientação de higiene bucal + RACR (manual com curetas metálicas Gracey e McCall - Trinity, em uma ou mais sessões) + Terapia fotodinâmica antimicrobiana (THEODORO et al., 2012). A TFDA foi aplicada uma única vez, logo após a finalização das sessões de RACR. Ela consistiu na irrigação subgengival da formulação fotossensibilizadora de cloro-alumínio ftalocianina (AlClFc) líquida, com o auxílio de uma seringa de insulina e sob isolamento relativo com roletes de algodão, preenchendo completamente a bolsa periodontal e revestindo a superfície radicular.

A AlClFc foi sintetizada, purificada e fornecida por Aldrich Chemical Company (St. Louis, MO, EUA). As amostras de AlClFc nanoparticuladas, na concentração de 5μM, utilizadas no experimento, foram gentilmente cedidas pelo Prof. Dr. Ricardo Bentes de Azevedo – UnB/Brasília. A incorporação da AlClFc para o sistema de entrega de drogas foi realizada de acordo com o método descrito por MUEHLMANN et al. (2014). A solução (0,5mL por sítio periodontal) foi aplicada diretamente no fundo da bolsa periodontal, mantida por cinco minutos (tempo pré-irradiação), e o extravasado de fotossensibilizador por fora da bolsa foi removido, para então ser aplicado o laser de baixa potência (660nm, Photon Lase III, DMC Equipamentos Ltda, São Carlos, São Paulo, Brasil).

A aplicação do laser, com 100 mW de potência, foi realizada nas bolsas periodontais irrigadas e a ponta da fibra ótica do laser posicionada paralelamente ao longo eixo do dente em contato com a margem gengival (sem penetrar na bolsa) por um período de 15 segundos. Óculos de segurança especiais foram utilizados pelo operador e pacientes para prevenir possíveis danos oculares causados pela irradiação a laser. Para os sítios periodontais com profundidades de sondagem maiores que 5mm ou que os pacientes relatassem desconforto durante instrumentação mecânica, foi realizada a anestesia infiltrativa local com Lidocaína a 2% com Fenilefrina 1:2500 (SS White, São Cristóvão, Rio de Janeiro, Brasil).

• Tratamento B (Grupo controle)

Orientação de higiene bucal + RACR (manual com curetas metálicas Gracey, em uma ou mais sessões). Para efeito de mascaramento do estudo, os sítios periodontais do grupo controle também receberam irrigação subgengival de mesmo volume e pelo mesmo tempo da realizada com a solução fotossensibilizadora, sendo que nesses foi utilizada solução salina a 0,89%. A ponta ativa do aparelho foi posicionada da mesma forma, pelo mesmo tempo, angulação e movimentos utilizados no grupo teste, contudo sem ativação do aparelho (procedimento placebo). O procedimento de irrigação e posicionamento da ponta ativa do laser ocorreu também sob isolamento relativo com roletes de algodão. Para os sítios com profundidades de sondagem maiores que 5mm, foi realizada a anestesia infiltrativa local com Lidocaína a 2% com Fenilefrina para evitar desconforto para o paciente durante instrumentação mecânica. A orientação de higiene bucal e um controle rigoroso do biofilme e cálculos dentários foram estabelecidos desde o início do estudo (T0) e aos três (T3) e seis (T6) meses, sendo que a cada quatro semanas os indivíduos foram solicitados a comparecerem às clínicas Integradas da UFRN para reforço das instruções de higiene bucal e procedimentos de controle do biofilme e remoção de cálculo dentário supragengival.

4.9.1 Coleta e armazenamento das amostras de saliva

As amostras de saliva foram coletadas no início do estudo (T0) e nos intervalos de tempo de três (T3) e seis (T6) meses após a realização de um dos tratamentos propostos, para análise da presença de biomarcadores de estresse oxidativo (GSH e MDA), tendo a coleta sido realizada por um único operador previamente calibrado. A saliva foi coletada através do método da expectoração, ou "método do cuspe" (Santos et al., 2007), no qual o paciente foi orientado a acumular saliva não-estimulada por 3 minutos e depois expectorá- la em um frasco específico transparente e limpo, entregues aos participantes do estudo. A saliva foi, então, depositada em tubos de Falcon estéreis e, em seguida, armazenadas a -80º C no próprio Departamento de Odontologia da UFRN, para posterior análise através da técnica do método de dosagem enzimática com detecção colorimétrica por espectroscopia UV/VIS, adaptado dos métodos propostos por Esterbauer; Cheeseman. (1990) e Siddique; Ara; Afzal. (2012).

4.9.1.1 Dosagem de antioxidante GSH.

A concentração de GSH foi avaliada pelo ensaio para determinação de grupos sulfidrílicos não proteicos (NP-SH) (SEDLAK & LINDSAY, 1968). As amostras de saliva armazenadas em tubos de Falcon a -80o_{C foram descongeladas para análise (Figura 5A).} Transferiu-se o volume ideal de 100μL de cada amostra de saliva para tubos eppendorfs de 2mL utilizando uma pipeta automática e calibrada (Figura 5B). Após isso, adicionou-se 1mL de EDTA 0,02M a cada eppendorf, seguido da homogeneização da amostra (Figura 5C). Em outros eppendorfs vazios, também de 2mL, adicionou-se 400μL do homogenato, 320μL de H2O destilada e 80μL de ácido TCA 50%. Em seguida centrifugou-se a mistura por 10 minutos a 4oC e 11.000 rpm em centrífuga específica (Figura 5D e 5E). Após centrifugação, transferiu-se para uma placa de 96 poços: 100μL do sobrenadante, 200μL de Tris (posto no coxinho e transferido para a placa usando pipeta multicanal) e 25μL de DTNB (também posto no coxinho e transferido para a placa usando pipeta multicanal) (Figura 5F). Após um tempo de espera de 15 minutos, a placa foi posicionada em um espectofotômetro (leitora de placas de ELISA) (Figura 5H e 5I), registrados os valores de absorbância que, em seguida, foram interpolados em curva padrão. A absorbância foi determinada através de método colorimétrico por espectroscopia UV/VIS, usando um leitor de placa (espectrofotômetro - Polaris) e interpolada com a curva padrão. Os resultados foram expressos em nmol/mL salivar.

4.9.1.2 Dosagem de marcador inflamatório MDA.

Em outro momento, obteve-se outra fração de saliva (100μL) das amostras descongeladas para análise (Figura 5A). Transferiu-se este volume para tubos eppendorfs de 2mL onde foram adicionados, também, 500μL de tampão Trizma HCL 20mM (proporção de 1:5 p/v) (Figura 5B). Em seguida, centrifugou-se a mistura por 10 minutos a 4oC e 11.000 rpm em centrífuga específica (Figura 5D e 5E). Após centrifugação, transferiu-se para outro eppendorf: 300μL do sobrenadante, 750μL do reagente cromogênico e 225μL de HCL 37%. Este material foi incubado em banho maria a 45o_C durante 40 minutos (Figura 5G). Depois repetiu-se a centrifugação agora por 5 minutos a 4oC e 11.000 rpm. Logo em seguida transferiu-se 300μL do sobrenadante para cada poço de uma placa de 96 poços (Figura 5F). Posteriormente, a placa foi posicionada em um espectofotômetro Polaris (leitora de placas de ELISA) (Figura 5H e 5I), registrados os

valores de absorbância que, em seguida, foram interpolados em curva padrão. A absorbância foi determinada através da colorimetria (586nM). Os resultados foram expressos em nmol/mL salivar.

Figura 5. Protocolo dos ensaios para determinação dos níveis de GSH e MDA.

Legenda: (A) Amostras de saliva armazenadas em tubos Falcon; (B) Transferência de amostra salivar para tubo eppendorf; (C) Homogeneização da amostra; (D e E) Centrifugação; (F) Alíquotas das amostras sendo adicionadas em placa multipoços; (G) Amostras incubadas em banho maria; (H) Espectofotômetro; (I) Leitura da placa no espectofotômetro.

4.10 PROCESSAMENTO E ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS DADOS

Para análise dos dados, as informações coletadas foram inseridas em uma planilha no Microsoft Excel e, em seguida, criado um banco de dados no programa Statistical Package for Social Sciences (SPSS®) na versão 20.0. A análise foi feita entre os parâmetros clínicos periodontais (ISS, IPV, PS e NIC), considerando o sítio periodontal doente (PS≥5mm) a unidade de análise, e os valores de concentração salivar de GSH e MDA. Foram realizados testes não paramétricos diante da ausência de normalidade dos dados. Aplicou-se o teste de Mann-Whitney para análise inter-grupo em cada tempo (T0, T3, T6), e o teste de Friedman para análise intra-grupo entre todos os períodos estudados. Ao ser observada diferença significativa, realizava-se o teste de Wilcoxon para identificar entre quais pares de períodos havia a diferença, com penalização de "p" valor multiplicado pelo número de comparações. Utilizou-se um nível de significância de 5% (p<0,05) para a avaliação intra-grupos e inter-grupos.