A bioconversão de pentoses em etanol é um processo complexo fortemente influenciado por uma série de fatores como condições de cultivo, tipo de meio de fermentação, tipo de processo empregado, entre outros. Durante o processo fermentativo visando à produção de etanol as leveduras encontram várias condições de estresse ao seu metabolismo, simultâneas ou sequenciais, impostas pelo processo, como altas concentrações de etanol no meio, alta pressão osmótica (quando submetidas a altas concentração de açúcar), formação de co-produtos indesejáveis ao metabolismo, pH, temperatura, entre outros (Basso et al., 2011).
O metabolismo fermentativo de S. stipitis (micro-organismo investigado neste estudo) é induzido pela resposta à limitação em oxigênio, sendo assim uma espécie anaeróbia facultativa (Correia, 2008). O processo de produção de etanol por S. stipitis é fortemente influenciado pelos níveis de oxigênio na cultura, uma vez que o excesso de oxigênio desvia o metabolismo do micro-organismo para promover acúmulo de biomassa
(Sunitha et at., 1999). Dessa maneira, a aeração é um fator crucial na fermentação de xilose, visto que a disponibilidade de oxigênio determina a divisão do fluxo de carbono da xilose entre crescimento e formação de produto, sendo, portanto, capaz de afetar drasticamente os parâmetros fermentativos (du-Preez, 1994). Antunes (1997) comprovou isto mostrando que o aumento da aeração promove o crescimento celular em detrimento da produção de etanol, e, por outro lado, uma redução na aeração favorece a produção em etanol, porém, com baixa produtividade. Silva (2001) mostrou que a produtividade em etanol por S. stipitis é favorecida por condições intermediárias de aeração (agitação = 200 rpm e razão Vfrasco/Vmeio = 2,5), onde foi alcançada produtividade em etanol (Qp) e o
rendimento em produto (Yp/s) de 0,39 g/L.h e 0,36 g/g, respectivamente.
Sabe-se também que nos processos de bioconversão o pH é um importante fator, sendo capaz de exercer grande influência no acúmulo de etanol. du-Preez (1994) reportou que o rendimento em etanol pela levedura P. stipitis CBS 7126 foi fortemente afetado por variações de pH entre 2,5 e 6,5, sendo que o pH ótimo se situa entre 4,0 e 5,5. Slininger et al. (1990b) relataram que para fermentação de xilose por S. stipitis NRRL Y-7124 a faixa de pH encontra-se na faixa entre 4 e 7, não sendo, nesta faixa, observada grande influência da variação do pH sobre os parâmetros fermentativos, e sendo o pH 4,5 o mais recomendável, por minimizar a possilibade de contaminação por bactérias (menos resistentes a este pH). Por outro lado, por este valor estar próximo do limite inferios da faixa ótima de fermentação, seria desejável o uso de um controle autotámico de pH, para evitar que os valores de pH no meio caiam abaixo deste nível e se torne tóxico ao metabolismo da levedura. É importante ressaltar que pH ótimo para o crescimento e/ou produção de etanol é função direta do micro-organismo estudado. Porém, as discrepâncias no comportamento de S. stipitis em função do pH e os valores ótimos, reportados na literatura, podem estar atribuídos a outras condições de processo, ao tipo de controle de pH e/ou a metodologia empregada para o cálculo dos parâmetros comparativos (du Preez et al., 1994; Kastner et al., 1996).
A temperatura é um dos parâmetros mais importantes ao metabolismo do micro- organismo, pois a temperatura de cultivo pode interferir na atividade metabólica das
linhagens. Em geral, a temperatura ótima de produção de etanol para espécies de levedura capazes de utilizar pentoses, como Scheffersomyces e Candida, encontra-se na região de 30 a 32 ºC, embora esta faixa de temperatura ótima de processo possa variar dependendo da cepa, do tipo de substrato e ainda da concentração de açúcar (Slininger et al., 1990; du- Preez, 1994). Uma avaliação da faixa de temperatura capaz de favorecer o processo de bioprodução de etanol a partir de xilose foi descrito por Slininger et al. (1990), que em seus estudos observaram que a máxima produtividade e concentração de etanol obtidas pela levedura Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124, a partir de 40 g/L de xilose, ocorreu na faixa de temperatura entre 23 e 30 ºC, variando pouco nesta região, e quando a concentração inicial de xilose foi elevada para 150 g/L, esta faixa foi deslocada para temperaturas entre 27 e 33 ºC. du-Preez et al. (1986) relataram que para leveduras como Scheffersomyces stipitis CBS 7126 e Candida shehatae CBS 2779 a máxima velocidade específica de crescimento, produtividade específica e produtividade volumétrica em etanol ocorrem em torno de 30 ºC, sendo observado nesta temperatura um curto tempo de fermentação, e que para S. stipitis, o rendimento em etanol permanece constante, com um valor de 0,42 g/g, até 33 °C, havendo um decréscimo para 0,29 g/g quando a temperatura foi elevada para 36 °C. A formação de xilitol, sub-produto do metabolismo durante a conversão de xilose em etanol, é mais sensível aos aumentos de temperatura, sendo que temperaturas inferiores geram maiores desvios para produção de xilitol (Barbosa et al., 1990). Cabe ainda ressaltar que a temperatura ótima do processo não só depende da linhagem, como também do substrato utilizado, sua concentração e presença de outros compostos.
Outro importante aspecto a ser considerado no processo de produção de etanol a partir de xilose é o efeito da concentração inicial de substrato sobre o rendimento do produto. Segundo Roberto et al. (1991) que estudou a produção de etanol a paritr de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana pela levedura S. stipitis CBS 5773, o rendimento em etanol não foi afetado em uma faixa de concentração inicial de xilose entre 20 e 99 g/L, permanecendo praticamente constante e próximo de YP/S = 0,38 g/g,
entretanto, para concentrações iniciais de xilose próximas a 145 g/L foi observada uma redução na conversão em etanol para cerca de YP/S = 0,27 g/g. Os autores observaram
também que a produtividade volumétrica de etanol foi favorecida pelo aumento da concentração inicial de xilose até 76 g/L, sendo que a partir desta concentração, a produtividade foi inibida. Resultados semelhantes foram encontrados por Antunes (1997), que observou que a concentração inicial ótima de substrato se concentra na faixa de 80 a 100 g/L, fornecendo um fator de conversão de substrato em produto (YP/S) em torno de 0,48
g/g, havendo quedas superiores a 50% na produtividade em etanol quando se utilizam concentrações superiores a 100 g/L. Recentemente, resultados similares foram encontrados por nosso grupo de pesquisa (Farias et al., 2014) que avaliou o comportamento cinético da linhagem S. stipitis NRRL-Y7124 em diferentes concentrações de xilose na faixa de 7 a 145 g.L-1, mostrando também que o rendimento em etanol é dependente da concentração de xilose, variando de 0,50 para 7 g.L-1 a 0,36 para 145 g.L-1. De acordo com Hinman et al. (1989) a concentração de substrato apresenta um grande impacto no rendimento de etanol a partir de xilose. Experimentos reportados na literatura realizados em baixa concentração de xilose resultaram em altos rendimentos em etanol (em torno de 97 % do rendimento teórico), e este resultado é de vital importância para processos fermentativos com S. stipitis, devendo estar linkados então com a aplicação de processos fermentativos que visem suprir esta necessidade, ou seja, manutenção de baixas concentrações de açúcar no meio, como é o caso do modo de operção contínuo ou batelada alimentada.
Em vista das altas concentrações de etanol obtidas no final de cada ciclo fermentativo (8 – 12 % v/v), o etanol é um dos maiores obstáculos de estresse que atacam o metabolismo da levedura (Basso et al., 2010). A cepa S. stipitis apresenta baixa tolerância ao etanol formado e aos ácidos alifáticos (derivados da hidrólise do bagaço), mas por outro lado apresenta alto rendimento em etanol a partir de pentoses, o que justifica o seu uso (Rossel, 2006). Essa tolerância difere para cada linhagem de levedura, sendo um parâmetro afetado pelas condições de cultivo, especialmente pela temperatura (du Preez et al., 1986). Hahn-Hagerdal et al. (1994) observaram que quando a xilose foi assimilada a 30 °C, o crescimento de S. stipitis CBS 7126 foi inibido por concentrações de etanol entre 32 e 34 g/L, e com a redução da temperatura, houve o aumento da tolerância ao etanol, sendo a concetração máxima precedente a total inibição do crescimento, 65 g/L a 25 °C. Segundo du-Preez et al. (1987), para a levedura S. stipitis CBS 7126, a máxima tolerância a etanol
ocorreu na faixa de temperatura entre 16 e 22 °C, sendo observado crescimento celular até uma concentração aproximada de 60 g/L de etanol, decrescendo esta tolerância a 32 ºC para 27,5 g/L e a 10 ºC para 47,5 g/L de etanol. Farias et al. (2014) avaliou a conversão de xilose em etanol pela linhagem S. stipitis NRRL-Y7124 a 28 °C, atingindo concentração máxima de etanol de 55 g.L-1, sendo que acima desta concentração o crescimento foi inibido.
Outro ponto relevante é que investigações realizadas com a linhagem S. stipitis NRRL-Y7124 encontrou-se uma tolerância ao etanol dependente da fonte de carbono (glicose ou xilose). Esta relação entre a tolerância e a fonte de carbono foi avaliada a partir do crescimento e a atividade da ATPase presente na membrana plasmática para cultivos com glicose ou xilose, sendo as melhores atividades observadas nos cultivos com a hexose (Meyrial et al., 1995). Somando-se a isso, para esta mesma linhagem, durante estudos realizados para avaliar o efeito inibitório do etanol foi observado que, a medida em que aumenta a concentração de produto acumulado no meio, o rendimento em xilitol, sub- produto consequente ao efeito inibidor, aumenta linearmente e, consequentemente, apresenta uma diminuição proporcional no rendimento em etanol (Delgenes et al., 1988, Jeffries et al., 2006).
Frente a isso, a tolerância das leveduras ao etanol é de vital importância para atingir altos níveis de produção e viabilizar a etapa de destilação do meio fermentado (du Preez et al. 1986). No entanto, o papel inibitório do etanol sobre o metabolismo de S. stipitis ainda não é completamente ententido. O efeito inibidor do etanol tem sido atribuído a fatores como o acúmulo de acetaldeído e acetato no interior das células, promovendo alterações nas membranas celulares, e ainda em alguns casos, efeitos sobre a osmose celular (Hahn- Hagerdal et al., 1994). Dessa maneira, o principal efeito inibitório do etanol é devido ao ataque na membrana citoplasmática das células de levedura (Thomas et al., 1978; Alezandre et al. 2001). Na presença de etanol, a fluidez da membrana, a qual está relacionada à sua composição lípica, é profundamente alterada, e, como resposta, a permeabiliada de membrana a alguns íons (especialmente H+) é significativamente afetada. Com os íons dentro das células, existe uma dissipação do gradiente eletroquímico através
da membrana, que por sua vez afeta a formação e manutenção da força próton motriz com consequente diminuição do pH intracelular, sendo então as alterações na estruturas da membrana celular e nos mecanismos de transporte considerados os principais efeitos inibitórios do etanol ao metabolismo celular (du-Preez et al., 1986; Basso et al., 2010).
Apesar destes problemas, processos fermentativos que atinjam altas concentrações de etanol são desejáveis a fim de reduzir o consumo de água e os custos de energia durante a etapa de destilação. Para contornar parte do problema, o desenvolvimento do processo fermentativo a vácuo proposto neste estudo apresenta-se como uma tecnologia atrativa por permitir a extração do etanol do meio fermentativo assim que ele é produzido, evitando então a inibição do micro-organismo ao produto formado e melhorando também dessa forma o desempenho do processo com aumento de rendimentos e produtividades. Espera-se também que esta condição, além de eliminar os efeitos inibitórios ao metabolismo celular, favoreça o balanço energético do etanol produzido com objetivo de melhorar a sustentabilidade do processo industrial.