Em suma, a deficiência da 21-hidroxilase é um modelo de doença monogênica com boa correlação genótipo/fenótipo. No entanto, alguns casos não se enquadram neste modelo como: pacientes com forma não clássica e genótipo incompleto (mutações não são encontradas em um ou ambos os alelos do gene CYP21A2), e pacientes que apresentam o genótipo e fenótipo não concordantes. Mutações no gene POR e a atividade de 21-hidroxilação extra-adrenal determinada por citocromos hepáticos P450s podem estar envolvidas na modulação do fenótipo na deficiência da 21-hidroxilase. A identificação de fatores moduladores, além de aumentar o nosso conhecimento da fisiopatologia da doença, poderá:
1) ser de grande utilidade para a definição diagnóstica e aconselhamento genético das famílias de risco.
2) auxiliar no desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas, como por exemplo, através do uso de drogas indutoras dos citocromos P450 com
consequente melhora na gravidade da doença. Este fato poderá repercutir na redução das doses da terapia com glicocorticóides e /ou mineralocorticóides e dos seus efeitos colaterais.
2 Objetivos
1a) Estudar o gene POR em pacientes com diagnóstico clínico e hormonal de forma não clássica da deficiência da 21-hidroxilase e genótipo incompleto, ou seja, genótipo em que mutações no gene CYP21A2 não foram identificadas em um ou ambos os alelos.
1b) Estudar o gene POR em pacientes com diagnóstico de deficiência da 21-hidroxilase e que apresentam fenótipo discordante do genótipo: forma clínica mais leve do que a predita pelo genótipo.
2) Avaliar se a 21-hidroxilação extra-adrenal pode modular a manifestação fenotípica da deficiência da 21-hidroxilase. Esta análise será realizada através do estudo dos tópicos a seguir:
2a) Avaliação da atividade in vitro de 21-hidroxilação da progesterona e 17OH-progesterona dos citocromos recombinantes humanos CYP2C19 e CYP3A4, e comparação com a atividade do P450c21 selvagem.
2b) Pesquisa de variantes alélicas ultra-metabolizadoras do citocromo CYP2C19 em pacientes com fenótipo mais brando do que o predito pelo genótipo, e comparação com as variantes presentes nos indivíduos que apresentam genótipo e fenótipo concordantes.
Este projeto foi aprovado pela Comissão de Ética para Análise de Projetos de Pesquisa – CAPPesq, da Diretoria Clínica do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (HC-FMUSP) (processo número 761/05). Após consentimento informado por escrito, obtivemos amostra de sangue periférico dos pacientes para extração de DNA genômico. As avaliações hormonais e todos os estudos moleculares foram realizados no Laboratório de Hormônios e Genética Molecular LIM 42 da Disciplina de Endocrinologia do HC-FMUSP. Osestudos funcionais foram realizados na Universidade da Califórnia São Francisco (UCSF), Estados Unidos.
3 Casuística
A casuística selecionada para este estudo consiste em 313 pacientes portadores de deficiência da 21-hidroxilase, sendo que 109 apresentaram a forma perdedora de sal, 79 a forma virilizante simples e 125 a forma não clássica. Na forma virilizante simples, todas as meninas apresentaram ambiguidade genital ao nascimento, e ambos os sexos apresentaram importante virilização na infância, com avanço da idade óssea na ausência de tratamento. Os pacientes com a forma perdedora de sal, além do quadro de virilização, apresentaram crise de perda de sal, caracterizada por desidratação acompanhada de hiponatremia e hipercalemia, ou hiponatremia associada à elevada atividade de renina
plasmática (ARP), nas primeiras semanas de vida. Os pacientes com a forma não clássica sintomática apresentaram pubarca precoce, irregularidade menstrual, acne, hirsutismo ou infertilidade. Na forma clássica, as concentrações de 17OH-progesterona basal foram maiores do que 50 ng/mL. Na forma não clássica, os pacientes foram submetidos ao teste de estímulo agudo com ACTH sintético (250 μg IV) na fase folicular do ciclo menstrual. Neste teste foi adotado como diagnóstico o valor da 17OH-progesterona > 15 ng/mL, 60 min após estímulo. Apesar do critério diagnóstico hormonal estabelecido na literatura ser 17OH-progesterona >10 mg/mL (20), optamos pelo valor da 17OH-progesterona pós-estímulo > 15 ng/mL, porque o estudo que avaliou heterozigotos obrigatórios na nossa população mostrou que esses indivíduos podem ter concentrações de 17OH-progesterona pós-estímulo entre 10 e 15 ng/mL (90).
Amostras de DNA dos pacientes foram submetidas previamente a estudo molecular do gene CYP21A2 através de técnicas de Southern
blotting e PCR alelo-específico; o sequenciamento foi realizado nas
amostras dos casos em que o genótipo não foi resolvido com a utilização das duas metodologias iniciais (42, 52, 91).
Foram selecionados 11 pacientes com quadro clínico de hiperandrogenismo tardio, diagnóstico hormonal de forma não clássica, e que permaneceram com genótipo incompleto, ou seja, pelo menos um alelo sem mutação identificada, após sequenciamento de todo gene CYP21A2 (Tabela 1). Sete pacientes apresentaram ao diagnóstico história de
irregularidade menstrual, acne e/ou hirsutismo, e quatro casos (3 meninas e 1 menino) história de pubarca precoce.
Foram selecionados 6 pacientes com deficiência da 21-hidroxilase, nos quais após o estudo molecular do gene CYP21A2, permaneceram com genótipo/fenótipo discordantes. Cinco pacientes apresentaram genótipo que predizia a forma perdedora de sal e fenótipo de forma virilizante simples e 1 paciente apresentava genótipo que predizia a forma virilizante simples e fenótipo de forma não clássica (Tabela 2).
Os pacientes que carreavam a mutação I2 splice foram excluídos do estudo, porque essa mutação está associada à variabilidade fenotípica, devido à presença de splicing alternativo (41).
Tabela 1 - Dados clínicos, hormonais e genéticos dos pacientes com a
forma não clássica da deficiência da 21-hidroxilase e genótipo incompleto
Paciente Sexo Idade ao Diagnóstico (anos) Quadro Clínico 17OHP Basal e Pós-ACTH (ng/mL) Genótipo CYP21A2 1 F 34 H, A, IM 3,3 / 32 I172N / - 2 F 12 H, IM 3,2 / 26 - / - 3 M 8 Pubarca Precoce 5,7 / 36 V281L / - 4 F 20 H, IM 3,5 / 44 V281L / - 5 F 20 H 11 / 147 I2 / - 6 F 63 H, A, IM 1,1 / 30 - / - 7ª F 8 Pubarca Precoce 50 / 83 V281L / - 8ª F 8 Pubarca Precoce 59 / 84 V281L / - 9b F 25 H, A 17 / 27 V281L / - 10b F 22 H, A 18 / 22 V281L / - 11 F 6 Pubarca Precoce 6,9 / 65 V281L / - - Mutação não identificada
a irmandade 1; b irmandade 2.
Tabela 2 - Dados clínicos, hormonais e genéticos dos pacientes com a deficiência da 21-hidroxilase e genótipo/fenótipo
discordantes
Pacientes Sexo Social/ Genético IC / IO ao Diagnóstico
(anos)
Quadro
Clínico 17OHP Basal (ng/mL)
Testosterona (ng/dL)/ Δ4
(ng/mL)
ARP Basal
(ng/mL/h) Genótipo CYP21A2 Fenótipo: Predito/ Observado 1 F / 46,XX 35 Infertilidade, Clitoromegalia (2 cm) 82,8 86 / 13,7 - Grande Conversão#/ IVS2-2A>G VS / NC 2 M / 46,XX 4,5 / 11 Aumento peniano 305 720* / 19,9* - R356W / R356W PS / VS
3 M / 46,XY 4,5 / 12,5 Aumento peniano,
Pubarca Precoce 54,5 735 / 7,4 6,5 Del 21A2** / Q318X PS / VS
4 M / 46,XY 5,3 / 11 Aumento peniano,
Pubarca Precoce 193,9 510 / 3,7 2,8 Del 21A2** / Del 21A2** PS / VS
5 M / 46,XY 1 / - Aumento peniano 240 /
153,3*
1.167* / 36,1* >25 R356W / Ins
T, V281L PS / VS
6 M / 46,XY 5 / 11,5 Aumento peniano,
Pubarca Precoce 141,3 170 / 10 18 Q318X / R408C PS / VS
*Dados hormonais dos pacientes n°s 2 e 5 foram obtidos aos 34 anos e 13 anos, respectivamente, sem tratamento de reposição hormonal. ** O ponto de quebra do gene híbrido foi estudado por PCR alelo-específico, e o gene híbrido apresenta a mutação Del 8nt do pseudogene, que abole a atividade enzimática e prediz a forma perdedora de sal. # Grande Conversão: o gene híbrido apresenta a região promotora e o exon 1 do pseudogene contendo a mutação P30L. F, feminino; M, masculino; IC, idade cronológica; IO, idade óssea; APR, atividade de renina plasmática; VS, virilizante simples; NC, não clássica; PS, perdedor de sal; Ins, inserção; Del, deleção; -, dado não disponível.
4 Métodos