As interferências que mais dão problemas são aquelas que dão o sinal de fundo na reação, contribuindo para aumentar a dispersão de luz. Em geral este tipo de interferência se deve a amostra que está sendo analisada ou aos reagentes usados. A filtragem dos reagentes, associados a centrifugação a alta velocidade ou a ultracentrifugação da amostra, ajudam a reduzir este sinal de fundo. Soros muito ictéricos ou hemolisados podem afetar a absorbância dos método turbidimétricos, esta interferência pode ser minimizada com a diluição da amostra antes de se processar o ensaio.
A qualidade do anticorpo usado no ensaio é crucial para o desempenho destas técnicas, pois como as proteínas presentes no soro podem apresentar várias formas, o reagente usado deve ser capaz de reagir com estas várias formas. Isto é especialmente útil em proteínas como a haptoglobina, cujas isoformas variam muito em termos de peso molecular. Os métodos nefelométricos e turbidimétricos, no entanto, são menos afetados pelas variações do tamanho molecular do que são os método de imunodifusão radial. Preparações de anticorpo que apresentam variações na ligação devido a presença de componentes monoclonais, devem ser evitadas sempre que possível. A concentração de proteína monoclonal pode ser estimada independentemente por métodos eletroforéticos. Qualquer variação no reconhecimento do anticorpo de uma preparação pode ser avaliado procedendo-se um teste de paralelismo através do limite do excesso de anticorpo em concentrações antigênicas. Isto é, a diluição de uma série de amostras de um soro deve mostrar uma série linear de resultados. Na verdade, este tipo de verificação pode ser estendido a todos os tipos de ensaios.
TESTE DE PAUL BUNNEL & DAVIDSOHN E MONOTESTE
A mononucleose infecciosa descrita em 1889 por Pfeiffer, também chamada Doença Glandular, Angina Monocítica, manifesta-se por febre contínua, angina, adenopatia cervical, astenia, suores profusos, esplenomegalia. Hoje, sabe-se, que seu agente etiológico é um vírus da família Herpesviridae denominado Epstein & Barr. Foi demonstrado por Epstein, Archong & Barr, em 1967, a partir de material de um paciente com linfoma de Burkitt.
DIAGNÓSTICO: A presença de anticorpos para o capsídio do vírus pode ser demonstrada por imunofluorescência indireta em presença de células linfoblastóides, produtoras de vírus, na fase aguda da infecção. É, porém um teste complicado e inacessível aos laboratórios de análises clínicas.
Devido a este fato, o diagnóstico da mononucleose infecciosa baseia-se na pesquisa de anticorpos heterófilos.
Dois testes são, comumente, usados para este diagnóstico: O MONOTESTE e a reação de PAUL-BUNNELL & DAVIDSOHN.
MONOTESTE: No monoteste usam-se hemácias formoladas de cavalo. Em uma lâmina comum de microscopia, coloca-se uma gota de soro do paciente (não necessita ser inativado).
Adicionam-se a este soro duas gotas de uma suspensão a 20% de hemácias formoladas de cavalo.
Agita-se imprimindo um movimento de rotação à lâmina. Dentro de dois a três minutos ocorre hemaglutinação. O teste pode, também ser feito em lâmina escavada. Ausência de hemaglutinação não exclui o diagnóstico para mononucleose.
121 REAÇÃO DE PAUL-BUNNELL & DAVIDSOHN: Esta prova é baseada na capacidade que tem o soro do doente de aglutinar hemácias de carneiro a uma diluição de 1:56 ou superior.
Entretanto, mesmo se ocorrer a aglutinação das hemácias de carneiro, o teste deve ser confirmado pela adsorção do soro do paciente com os antígenos de rim de cobaia e glóbulos, de boi separadamente.
Técnica da reação:
Material necessário:
- Soro do paciente inativado - Micropipeta de 20 µl
- Placa de vidro escavada (a mesma que se usa para o VDRL) - Hemácias de carneiro a 2% em salina
- Glóbulos cozidos de boi (antígeno)
- Extrato de rim de cobaia (antígeno de Forssman) - Solução de NaCl a 0,85%.
Realização do teste:
1 - A uma lâmina com pelo menos oito escavações, adicionar 20 µl de solução salina;
2 - Na primeira escavação adicionar 20 µl do soro do paciente. Homogeneizar com a mesma ponteira, passando 20 µl para a 2a cavidade, daí para a terceira e assim, sucessivamente, até a última, quando desprezamos 20 µl. Temos assim, o soro diluído a 1/2, 1/4 até 1/256;
3 - Adicionar a cada diluição do soro 20 µl de uma suspensão de hemácias de carneiro a 2%, em salina. Homogeneizar, imprimindo à lâmina um movimento de rotação. A aglutinação das hemácias ocorrerá dentro de 1 a 2 minutos até certa diluição ou pode não haver aglutinação se o soro não possuir hemaglutininas.
Uma hemaglutinação produzida pelo soro até à diluição de 1:32, é um teste que não indica a mononucleose. Pode-se dar como negativo. Se porém, houver hemaglutinação até a uma diluição do soro de 1/64 ou maior, há uma forte suspeita de ser mononucleose. Neste caso o soro dever ser absorvido com glóbulos de boi (0,1 ml de Gb + 0,4 ml do soro) e com rim de cobaio (0,1 ml de Rc + 0,4 ml do soro). Misturam-se soro e antígeno em um tubo de hemólise, deixar no banho maria a 37°C por 30 minutos, centrifugar e repetir a reação com o sobrenadante do mesmo modo que se procedeu para a prova direta com as hemácias de carneiro. Para isto destacar duas fileiras na placa, uma para Gb e outra para Rc.
Em cada fileira, adicionar 20 µl de salina em cada cavidade e diluir, como anteriormente, o soro tratado (uma fileira para Gb e outra para Rc).
Adicionar em cada cavidade 20 µl de hemácias de carneiro e homogeneizar, com movimentação de rotação.
4 - Após 2 a 3 minutos proceder a leitura, observando o título do soro, em cada fileira. O título será a maior diluição do soro onde houver hemaglutinação completa.
Observações: O antígeno de glóbulos de boi absorve o anticorpo do soro no caso de mononucleose infecciosa e da doença sérica. O antígeno de rim de cobaio absorve os anticorpos de Forssman.
Em determinado soro, se o título da prova direta for de 1:128 e após à absorção com Gb e Rc não ocorrer hemaglutinação, não se trata de mononucleose e sim de doença do soro.
Se por acaso ocorrer hemaglutinação pelo soro tratado com Rc a uma diluição de 1:64, por exemplo, e com Gb não ocorrer hemaglutinação, trata-se de mononucleose.
Se se tratarem de anticorpos de Forssman, não haverá hemaglutinação no soro tratado com Rc, mas haverá hemaglutinação no soro tratado com Gb.
Resumindo teremos:
DIFERENCIAÇÃO DAS AGLUTININAS ANTI-HEMÁCIAS DE CARNEIRO
DIAGNÓSTICO PROVA DIRETA
HEMÁCIAS DE CARNEIRO
SORO ABSORVIDO COM
Rc Gb
Doença do soro 128 - -
Mononucleose 128 64 -
Soro normal 128 - 64
Deve-se esclarecer que a reação clássica de Paul-Bunnell & Davidsohn era feita em tubos e com diluições de 1/7, 1/14 ... 112 ou mais. Considerava-se, neste caso, como suspeito de mononucleose infecciosa, um paciente cujo soro apresentasse, na prova direta um título igual ou superior a 1:56. Nestas condições absorvia-se o soro com Rc e Gb para diferenciação das hemaglutininas.
Observação: O sangue de carneiro usado deve ser conservado em solução de Alsever, outros anticoagulantes diminuem a sensibilidade das hemácias e prejudicam o teste.