Uma vez que o nosso protocolo para geração de DCs humanas se mostrou eficiente na geração dessas células, o próximo passo foi estudar os efeitos do tratamento dessas DCs no dia cinco da cultura, portanto imaturas, com partículas carregando peptídeos e/ou P2C. Assim, foram adicionados às células, peptídeos e/ou P2C, adsorvidos em partículas de sílica. No dia sete, essas células foram coletadas e submetidas à citometria de fluxo para análise das moléculas de superfície. Além dos marcadores já mencionados, foi analisado também o tamanho (Forward scatter) e a granulosidade (Side scatter) das células, como pode ser observado na figura 7.
Figura 7 - Density Plots mostrando as populações celulares, de acordo com seu tamanho (Forward scatter) e granulosidade (Side scatter).
Células mononucleares separadas por gradiente de Ficoll-Paque foram enriquecidas por aderência em Placa de Petri e cultivadas em meio R-10 na presença de GM-CSF e IL-4 e submetidas às diferentes condições de cultura, especificadas em Material e Métodos. Após a cultura, as células foram analisadas em citômetro de fluxo.
É interessante notar que houve uma alteração clara na granulosidade das células, nos grupos tratados com partículas contendo peptídeo e/ou P2C. O aumento na granulosidade das células indica a associação dessas partículas às células, o que sugere (embora não confirme) que foram capturadas pelas DCs. Isso será mostrado em detalhes mais adiante.
Em seguida, nas células de maior tamanho e granulosidades e negativas para Lin (vide figura 2 em Material e Métodos) foi analisada a porcentagem de células HLA- DR+CD11c+ (Figura 8).
Figura 8 - Porcentagem de células duplo-positivas para HLA-DR e CD11c, dentro do “gate” Lin-.
Células mononucleares separadas por gradiente de Ficoll-Paque foram enriquecidas por aderência em Placa de Petri e cultivadas em meio R-10 na presença de GM-CSF e IL-4 e submetidas às diferentes condições de cultura, especificadas em Material e Métodos. Após a cultura, as células foram marcadas com anticorpos para as moléculas de membrana HLA-DR, CD11c e Lin (coquetel de anticorpos marcados com FITC, contendo anti-CD3, CD14, CD19 e CD56) e analisadas em citômetro de fluxo. Para análise estatística foi empregado teste ANOVA seguido de teste de comparações múltiplas de Tukey. O valor de p refere-se a comparação grupo sem tratamento x grupo tratato; *p< 0,05. O traço indica a média e a barra indica o erro padrão da média.
Conforme exibido na figura acima, observamos uma média de aproximadamente 80% de células duplo positivas que não sofreu variação significativa entre os grupos.
Posteriormente, na população Lin-HLA-DR+CD11c+, consideradas como DCs, mostramos a porcentagem e o nível de expressão das moléculas co-estimuladoras CD80 e CD86, e do marcador de ativação CD83 (figura 9). Os valores correspondentes aos níveis de expressão das moléculas foram designados como MFI relativa. A MFI
relativa foi obtida a partir dos valores de intensidade média de fluorescência (MFI, do inglês, mean fluorescence intensity) das células para o marcador analisado, normalizada pela intensidade do mesmo, nas DCs sem tratamento (DCs imaturas). Assim, o valor atribuído para o grupo de DCs sem tratamento é sempre um.
Figura 9 - Expressão das moléculas co-estimuladoras CD80 e CD86 e do marcador de DCs maduras, CD83 (no meio) em DCs (Lin-HLA-DR+CD11c+).
Células mononucleares separadas por gradiente de Ficoll-Paque foram enriquecidas por aderência em Placa de Petri e cultivadas em meio R-10 na presença de GM-CSF e IL-4 e submetidas às diferentes condições de cultura, especificadas em Material e Métodos. Após a cultura, as células foram marcadas com anticorpos para as moléculas de membrana HLA-DR, CD11c e Lin (coquetel de anticorpos marcados com FITC, contendo anti-CD3, CD14, CD19 e CD56), e CD80, CD83 e CD86 e analisadas em citômetro de fluxo. Os gráficos da esquerda mostram porcentagem de células positivas e os da direita, o nível de expressão das moléculas. Para análise estatística foi empregado teste ANOVA seguido de teste de comparações múltiplas de Tukey. O valor de p refere-se a comparação grupo sem tratamento x grupo tratato; *p< 0,05; **p< 0,01; ***p< 0,001. O traço indica a média e a barra indica o erro padrão da média.
Para a molécula co-estimuladora CD80, a média da porcentagem de células positivas foi de 80% para as DCs sem tratamento. Nos grupos que receberam as partículas ou o coquetel de citocinas, a porcentagem de células positivas não foi significativamente alterada. Por outro lado, o nível de expressão dessa molécula nas células foi mais alto nos grupos que receberam partículas contendo P2C ou o coquetel de citocinas. Efeito semelhante foi observado para a molécula CD86, sendo expressa em 78% das DCs sem tratamento e com um discreto aumento nos grupos que receberam P2C ou o coquetel de citocinas. No entanto, as células que receberam partículas contendo P2C ou coquetel de citocinas tiveram aumento significativo no nível de expressão da molécula, comparado com o grupo não tratado ou com os grupos que receberam partículas contendo somente um dos peptídeos.
É interessante notar que a maioria das DCs imaturas já expressava as moléculas co-estimuladoras CD80 e CD86, porém em baixos níveis. A expressão dessas moléculas permaneceu constante nos grupos tratados com qualquer dos peptídeos, mas sofreu um aumento dramático ao se adicionar as partículas contendo P2C ou o coquetel de citocinas inflamatórias.
Ao contrário do observado para as moléculas co-estimuladoras CD80 e CD86, que foram expressas na maioria das DCs imaturas, o CD83 foi expresso em baixa porcentagem de células, quando imaturas. Ao se adicionar partículas contendo P2C ou citocinas inflamatórias solúveis, houve um aumento significativo, tanto na porcentagem de células positivas quanto no nível de expressão da molécula, conforme pode ser visto na figura 9.