Fenotipagem das células para avaliação da proliferação e CIC

A caracterização fenotípica dos linfócitos foi realizada nos esplenócitos incubados durante 5 dias e obtidos de acordo com a descrição anterior. Quatro horas antes do término do

38 período de 120 horas de cultura, as placas destinadas à avaliação da proliferação e CIC foram tratadas com Brefeldina A (Sigma Co.) na concentração de uso (200 μg/mL). Quinze minutos antes do término do período de cultura foi acrescentado EDTA (concentração final 2 mM) em cada poço. Após o tempo de incubação, as placas foram centrifugadas a 1.500 rpm durante 5 minutos a 4ºC para a retirada do CMBlast. O sobrenadante foi descartado e as células ressuspendidas com auxílio de um agitador do tipo vortex. Posteriormente, foram adicionados 200 µL de PBS 1X e a placa centrifugada a 1.500 rpm por 5 minutos. O sobrenadante foi descartado e foram adicionados 100 µL de PBS 1X contendo o marcador de viabilidade celular,

Fixable Viability Stain 780 (FVS780), em cada poço, seguido de incubação por 15 minutos. Após

esse período de incubação, foram adicionados 100 µL de tampão PBS-Wash e, posteriormente, todo o conteúdo foi centrifugado a 1.500 rpm por 5 minutos a 4ºC. Subsequentemente, o sobrenadante foi descartado e as células ressuspendidas em vortex. A suspensão celular foi marcada com painéis contendo combinações distintas de anticorpos para a avaliação da proliferação celular/CIC.

O painel para a avaliação da proliferação/CIC foi composto por anticorpos contra moléculas de superfície e citocinas de camundongo, assim foi usado o seguinte painel de anticorpos: anti-CD3 BV650, anti-CD4 BV605, anti-CD8 BV786, anti-IFN-γ ALEXA 700, anti- TNF-α PE-CY7 e anti-IL-2 PE conforme descrito no Quadro 2. Foram utilizados controles de isotipo e todos os anticorpos foram diluídos em solução tampão PBS contendo proteínas inertes. A incubação com 50 µL do coquetel de anticorpos de superfície foi realizada por 30 minutos, ao abrigo de luz. A seguir, as células foram fixadas adicionando-se 150 µL de solução de lise/poço (citrato de sódio, formaldeído, dietilenoglicol e heparina). Após a fixação, as células foram permeabilizadas com 200 µL de PBS-P (solução tampão de PBS-Wash acrescido de 5% de saponina) por 10 minutos. A placa foi centrifugada a 1.500 rpm por 5 minutos a 4ºC. O sobrenadante foi descartado, a placa agitada em vortex, e as células foram incubadas com os anticorpos de CIC por 30 minutos. Após esse período, foram adicionados 200 µL de PBS-Wash e a placa foi centrifugada a 1.500 rpm por 5 minutos a 4ºC. O sobrenadante foi descartado e as células ressuspendidas em 300 µL de solução fixadora - MFF (paraformaldeído 10 g/L, cacodilato de sódio 1%, cloreto de sódio 6,67 g/L em pH 7,2). Após esse procedimento, as células foram transferidas para tubos de 500 µL poliestireno (Sarstedt®). Os eventos foram adquiridos no citômetro LSR Fortessa (BD Biosciences) no laboratório multiusuário de

39 citometria de fluxo do Núcleo de Pesquisas em Ciências biológicas NUPEB/UFOP. Foram usadas Beads (CompBeads) específicas para a compensação do citômetro. Para análise dos dados foi o empregado o programa FlowJo®.

Quadro 2: Lista de marcadores utilizados na avaliação de citocinas intracitoplasmáticas.

Marcador* Fluorocromo Clone Diluição Função

CD3 BV650 145.2C11 1:100 Define população de linfócitos T CD4 BV605 RM4-5 1:200 Define subpopulação de linfócitos T auxiliares CD8 BV786 53-6.7 1:400 Define subpopulação de linfócitos T citotóxicos IFN-γ AF700 XMG1.2 1:50 Citocina Th1 TNF-α PE-Cy7 LG.3A10 1:200 Citocina Th1

IL-2 PE JES6-5H4 1:100 Citocinas que induz proliferação celular * Todos os anticorpos monoclonais foram produzidos pela empresa BD Biosciences.

6.2.5 Fenotipagem das células para avaliação da proliferação e CIC

A caracterização fenotípica dos linfócitos T de memória foi realizada ao término do período de 120 horas do protocolo descrito anteriormente. Após o tempo de 5 dias, as placas contendo os esplenócitos foram centrifugadas a 1.500 rpm durante 5 minutos a 4ºC para a retirada do CMBlast. O sobrenadante foi coletado e as células ressuspendidas em vortex. Posteriormente, foram adicionados 200 µL de PBS 1X e a placa centrifugada a 1.500 rpm por 5 minutos. O sobrenadante foi descartado e em cada poço foram adicionados 100 µL de PBS 1X contendo o marcador de viabilidade celular, Fixable Viability Stain 780 (FVS780, seguido de incubação por 15 minutos. Após esse período de incubação, foram adicionados 100 µL de tampão PBS-Wash em cada e, posteriormente, a placa foi centrifugada a 1.500 rpm por 5 minutos a 4ºC. Posteriormente, o sobrenadante foi descartado e as células ressuspendidas em vortex. A suspensão celular foi marcada com painéis contendo combinações distintas de anticorpos para a avaliação de células T de memória. O painel multifuncional foi composto por anticorpos de superfície contra moléculas de células T de camundongo: anti-CD3 FITC, anti-CD4 BV605, anti- CD8 PERCP-Cy 5.5, anti-CD44 APC, anti-CD62L ALEXA 700, anti-CD127 BV510, anti- CD45RA BV711 e anti-CD197 BV421. No Quadro 3 estão descritos os anticorpos

40 detalhadamente. Todos os anticorpos foram diluídos em solução tampão PBS 1X acrescido de proteínas inertes.

A incubação com 50 µL do coquetel de anticorpos de superfície foi realizada por 30 minutos, ao abrigo de luz. Após a incubação, as células foram tratadas com 150 µL de solução de lise/poço por 10 minutos. A placa foi centrifugada a 1.500 rpm por 5 minutos a 4ºC. O sobrenadante foi descartado, a placa agitada em vortex e as células ressuspendidas em 200 µL de PBS-Wash. A placa foi novamente centrifugada a 1.500 rpm por 5 minutos a 4ºC, o sobrenadante descartado e as células ressuspendidas em vortex, cuidadosamente. O sobrenadante foi descartado e as células ressuspendidas em 300 µL de solução fixadora - MFF (paraformaldeído 10 g/L, cacodilato de sódio 1%, cloreto de sódio 6,67 g/L em pH 7,2). Após esse procedimento, as células foram transferidas para tubos de 500 µL poliestireno (Sarstedt®). Os eventos foram adquiridos no citômetro LSR Fortessa (BD Pharmingen). Foram usadas Beads (CompBeads) específicas para a compensação do citômetro. Para análise dos dados foi o utilizado o programa

FlowJo®.

Quadro 3: Lista de anticorpos utilizados para fenotipagem de células T nos experimentos funcionais.

Marcador* Fluorocromo Clone Diluição Função

CD3 FITC 17A2 1:200 Define população de linfócitos T CD4 BV605 RM4-5 1:200 Define subpopulação de

linfócitos T auxiliares CD8 PerCP Cy5.5 53-6.7 1:200 Define subpopulação de

linfócitos T citotóxicos CD44 APC IM7 1:100 Define células de memória. CD45RA BV711 14.8 Define células naïve e de

memória CD62L AF 700 MEL-14 1:400

Ligante de L-selectina. Distingue células T naïve,

efetoras e de memória CD127 BV510 SB/199 1:400 Receptor de IL-7 CD197 BV421 4B12 1:100 Receptor de CCR7 * Todos os anticorpos monoclonais foram produzidos pela empresa BD Biosciences.

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