FERMENTAÇÃO EM ESTADO SÓLIDO PARA PRODUÇÃO DAS ENZIMAS

Para produção de enzima o método empregado foi desenvolvido por Leite (2007) para o fungo thermofílico Thermoascus aurantiacus CBMAI756 e para o fungo mesofílico

Aspergillus níger NRRL 3122 foi o desenvolvido por Casciatori (2012).

4.2.1 Inóculo.

A partir da cultura de manutenção do fungo Thermoascus aurantiacus CBMAI756 da coleção do Laboratório de Bioquímica e Microbiologia Aplicada do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista, campus de São José do Rio Preto, que estava mantida em tubos de ensaio com PDA (Potato Dextrose Agar) inclinado, submerso em óleo mineral, em câmara fria a 5ºC, esta foi inoculada em 2 erlenmeyers com 50 mL de Ágar Sabouraud inclinado para a ativação do fungo sendo incubadas a 50ºC durante 48 horas. A cultura do fungo Aspergillus níger NRRL3122 fornecidos pelo laboratório de Bioprocessos do departamento de Engenharia de Alimentos do mesmo instituto que encontrava-se em tubos de ensaio com PDA (Potato Dextrose Agar) inclinado, submerso em óleo mineral, foram inoculadas para ativação em 2 erlenmeyers com 50 mL de PDA, Potato Dextrose Ágar, inclinado e incubado a 35ºC por 7 dias.

4.2.2 Solução Salina.

Foi utilizada como solução salina para o crescimento em estado sólido dos fungos

Thermoascus aurantiacus e Aspergillus níger a solução 0,35% de (NH4)2SO4, 0,3% de

KH2PO4, 0,05% de Mg2SO4⋅7H2O e 0,05% de CaCl2 proposta por Toyama e Ogawa (1978),

as soluções foram previamente esterilizadas em autoclave a 121 ºC e 1 atm durante 30 minutos.

4.2.3 Fermentadores.

Os fermentadores utilizados foram feitos com sacos de polipropileno de 15 x 30 cm, acoplados com bocal de PVC de 3,5 cm de comprimento e 1,5” de diâmetro, fechados com tampão de algodão envolto por gaze, para garantir a troca de gazes e assegurar que não houvesse contaminação por outros microrganismos.

Bagaço de cana-de-açúcar e farelo de trigo foram lavados com água e secos em estufa com circulação de ar quente a 50 ºC, o bagaço de cana foi separado em peneira para remoção da fração maior que 5,64 mm, em seguida peneirado em peneira granulométrica e descartada a fração menor que 2 mm, foram utilizados 5,0 g de substrato por fermentador, dos quais para o fungo T. aurantiacus foi na proporção de 1:1 e para o A. níger foi utilizado 3,5 g de bagaço de cana-de-açúcar e 1,5 g de farelo de trigo.

4.2.4 Contagem de esporos e inoculação.

Após 2 dias de incubação do inoculo de Thermoascus aurantiacus e 7 dias para

Aspergillus níger as células e os esporos, respectivamente, de cada erlenmeyer foram

suspensos, por cuidadosa raspagem com alça de platina, em 50 mL da solução salina. A quantidade de esporos foi determinada em câmara de Neubauer, seguida de contagem em microscópio ótico. Os fermentadores contendo os substratos esterilizados foram inoculados com volumes de suspensão padronizados com 5,0x107 células e esporos, e completados com solução salina para um volume final de 20,0 mL resultando em 80% de umidade.

4.2.5 Fermentação em estado sólido (FES).

Os fermentadores contendo o substrato seco foram inoculados e incubados 50ºC para o fungo Thermoascus aurantiacus durante 5 dias e 35ºC para o fungo Aspergillus níger durante 7 dias.

As enzimas foram extraídas pela adição de 100 mL de água destilada a temperatura ambiente e homogeneizadas para desaglomeração dos micélios. A suspensão foi então transferida para erlenmeyers de 250 mL, em que permaneceu em agitador orbital a 150 rpm por 1 hora. Após agitação as amostras foram centrifugadas a 10000g durante 20 minutos a 5°C, para remoção de células e outras partículas sólidas em suspensão.

4.2.6 Ultrafiltração.

A fim de obter extrato mais puro, concentrado e ter em menor volume maior concentração de enzima para ajustar o brix posteriormente, o extrato bruto foi concentrado utilizando o sistema QuixStandTM Benchtop da Amershan Bioscience com membrana miliporosa de 10kDa, utilizando unidade de ultrafiltração com pressão de 15psi. O extrato foi concentrado cerca de 10 vezes (v/v), seguido de medida de atividade enzimática.

4.2.7 Caracterização do Extrato Enzimático.

4.2.7.1 Atividade enzimática - β-glicosidase.

As atividades de β-glicosidase dos complexos enzimáticos estudados foram determinadas pela quantificação de p-nitrofenol liberado pelas enzimas a partir de 4- nitrofenil-β-D-glicopiranosídeo (PNPβG, Sigma) usado como substrato. Foram adicionados 250 µ L de tampão acetato 0,1M, pH 5,0, e 250 µ L de PNPG 4mM a 50 µL do filtrado enzimático, reagindo por 10 minutos a temperatura de 70ºC para o fungo Thermoascus

aurantiacus e 60ºC para o fungo Aspergillus níger. A reação enzimática foi paralisada com 2

mL de carbonato de sódio 2M. O p-nitrofenol liberado reagiu com a base e produziu o p- nitrofenolato(coloração amarela) e este foi quantificado por espectrofotometria em λ=410 nm. Uma unidade de β-glicosidase corresponde ao total de enzima que libera 1μM de p-nitrofenol por minuto no meio reacional.

4.2.7.2 Determinação de Proteína Total.

O teor total de proteína foi quantificado através do método de Lowry et al., (1951), utilizando soro albumina bovina como padrão analítico.

4.2.7.3 Características físico-química dos extratos ricos em β-glicosidase produzido pelos fungos A. níger e T. aurantiacus.

A determinação do efeito do pH sobre a atividade enzimática de ß-glicosidase foi realizada incubando-se 0,05 mL das enzimas em 0,25 mL do substrato p-nitrofenil ß-D- glicopiranosídeo 4mM (pNPG, Sigma), em diferentes valores de pH e os tampões da Tabela 3 para cada pH específico. A atividade enzimática foi quantificada a 60°C para o fungo A.níger,

70ºC para o T. aurantiacus e paralisada com carbonato de sódio 2M após 10 minutos de reação.

Tabela 3. Soluções tamponantes utilizadas para medição do pH ótimo.

Tampão (0,1M) pKa pH Glicina – HCl 2,4 3 Acetato de Sódio 4,8 4 e 5 Citrato de Sódio 6,4 6 Fosfato de Sódio 7,2 7 e 8 Glicina – NaOH 9,8 9 e 10

O efeito da temperatura sobre a atividade enzimática foi realizado incubando-se 0,05 mL da β-glicosidase nas mesmas condições descritas para a determinação da atividade, em diferentes temperaturas, variando entre 40 e 90°C. Os ensaios de atividade foram realizados em tampão acetato de sódio 0,1M no pH ótimo das respectivas enzimas.

4.2.7.4 Efeito da glicose e etanol sobre a atividade das enzimas.

Para a determinação do efeito da glicose e etanol sobre a atividade das enzimas, foi utilizado pNPßG (2 mM) como substrato. A atividade enzimática foi quantificada com a adição destes compostos, em diferentes concentrações, na mistura de reação (0–100 mM de glicose e 0–20% de etanol). Os ensaios foram realizados a 60°Cem tampão acetato de sódio 0,1 M pH 4,5.