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O estriol não foi detectado nas duas amostras e a diidrotestoste- rona só foi detectada, em fraca quantidade, nos machos da amostra J. Na mesma amostra, e quer para os machos quer para as fêmeas, foram encon- tradas a desidroepiandrosterona e a androsterona, esta última em maior quantidade. Na amostra II foi detectada a androsterona e o androstane- diol, tanto nos machos como nas fêmeas, em quantidades semelhantes.
Se "bem que esta técnica fosse eminentemente qualitativa, permitiu no entanto dar uma indicação da quantidade relativa de cada esteróide na amostra analisada, como mostra o quadro 3.
QUADRO 3 - Quantidades relativas em esteróides obtidas por Cromatografia Gás-Líquido - Espectrometria de Massa
Amostra I Amostra II Progesterona ++++ ++ + Androstenediona +++ +++ Testosterona ND ND Estradiol NI + Estrona NI + + + ++ + ND ND - n ã o detectado NI - não injectado + + + ND + +
A grandeza dos valores é representada de + a ++++
N o quadro k estão descritas a s quantidades dos esteróides r e f e r i - dos a peso fresco, peso seco e lípidos t o t a i s , obtidos no r a d i o i m u n o e n - saio.
C o m o se pode observar a progesterona foi o esteróide doseado e m
maior quantidade. A quantidade deste esteróide, referida a lípidos totais, encontrada nos machos da amostra I, foi praticamente o dobro da doseada para as fêmeas. Já na amostra II os valores apresentados foram
QUADRO 4 - Níveis de progesterona, androstenediona, testosterona, estradiol e estrona obtidos no radioimunoensaio
ng/g peso fresco ng/g peso seco ng/g lípidoa totais
a s a ? * t Proges tarons Amostra I Amostra II 5,07 0,29 A,75 0,63 42,72 1,74 31,14 3,44 341,77 14,47 188,40 23,67 Androstenediona Amostra I 3,23 3,68 26,69 24,10 217,69 145,80 Amostra II 0,86 1,13 5,10 6,17 42,40 42,46 Testosterona Amostra I 0,16 0,20 1,31 1,33 10,59 8,06 Amostra II 0,72 0,51 4,31 2,75 35,85 18,94 Estradiol Amostra I 0,021 0,023 0,174 0,157 1,41 0,95 Amostra II 0,038 0,053 0,226 0,288 1,88 1,97 Estrona Amostra I 0,048 0,045 0,403 0,294 3,26 1,78 Amostra II 0,055 0,080 0,330 0,437 2,74 3,01
20 vezes menores nos machos e cerca de 10 vezes menores nas fêmeas quando relacionados com os da amostra I. Se compararmos estes valores com as quantidades relativas indicadas pelo método GLC-EM (quadro 3), esta ordem de grandeza não é alterada.
h
Para a A -androstenediona os valores doseados nos machos da amos- tra I sao também superiores aos das fêmeas, sendo os encontrados na GLC-EM um sinal indicativo de que este esteróide estava em quantidade facilmente detectável. Na amostra II os valores são menores, quer para os machos quer para as fêmeas, mas muito idênticos entre si; na GLC-EM pôde-se observar a indicação da sua existência em fraca quantidade.
Passando agora a referir a testosterona, qualquer que seja o parâ- metro a que for referida, a quantidade deste esteróide é sempre supe- rior nos machos, no que respeita à amostra II; pela análise em GLC-EM só foi possível obter o espectrograma da testosterona para os machos da amostra II. Estes resultados discordantes poder-se-iam justificar pela
existência de interferências no radioimunoensaio, devido à existência de reacções cruzadas descritas abaixo.
Quanto ao 173-estradiol, os resultados obtidos mostram quantidades muito próximas, quer para os machos quer para as fêmeas, das duas amos- tras. A pequena discrepância entre os valores dos machos e das fe"meas da amostra I nota-se unicamente quando são referidos a lípidos totais; a análise em GLC-EM deu a indicação de quantidades pequenas, mas ainda detectáveis.
Os valores de estrona encontrados são também muito baixos e pró- ximos entre si, o que está de acordo com o GLC-EM, com excepção para os machos da amostra II, em que nao foi detectada, talvez por apresentar um tempo de retenção muito próximo de qualquer impureza existente e em quantidade superior.
Convém referir por fim as reacções cruzadas descritas para o radioimunoensaio entre cada esteróide e o soro antiesteróide respecti- vo: 100? progesterona - 6$ desoxicorticosterona 39$ 5a-diidroprogesterona 100$ A -androstenediona - 11,6% androsterona 2,7$ adrenosterona
100$ t e s t o s t e r o n a - 1+5$ 5ct-diidrotestosterona
22$ 56-diidrotestosterona 100$ 173-estradiol - 7,0$ 6-oxo-176-estradiol 3,3$ estrona 100$ estrona - 2,90$ estradiol 0,04$ estriol 28DISCUSSÃO
Estudos bastante complexos sobre a metabolização dos esteróides em invertebrados, feitos na década de setenta, usando precursores marcados com tritium (■%) e carbono ( C), vieram confirmar a existência nestes animais de algumas das enzimas intervenientes na biossíntese das hormo nas esteróides.
Fazendo uma revi sao do trabalho desenvolvido até ao presente foi possível constatar que os moluscos, e dentro destes a classe dos gas trópodes pulmonados terrestres, estavam em primeiro lugar no conheci mento endócrino, tanto na biossíntese como no mecanismo de regulação hormonal.
Gottfried e Dorfman (1970) demonstraram vim metabolismo activo da androstenediona pela fracção mitocondrialmicrossomal do género
Ariolimax, obtendo como produtos finais o 3ctandrostanediol e o
3gandrostanediol, na presença e na ausência do tentáculo óptico. Os mesmos autores, com a utilização de precursores marcados, estabeleceram a seguinte sequência metabólica para a fase masculina da glândula hermafrodita deste gastrópode:
colesterol ■+• pregnenolona ■*• 17ahidroxipregnenolona *■ ♦ desidroepiandrosterona *• androstenediona
Ainda dentro da mesma classe, e em Crepidula fornicata, Bardon et ai. (l97l) puseram em evidência, nas gónadas e no hepatopâncreas
deste animal, a presença da Cy, 2o_liase> da 36hidroxiesteróide desi
drogenase (3BH5D), da A5' isomerase e da 173hidroxiesteróide desi
drogenase (17BHSD), enzimas activas na biossíntese de esteróides. Estes autores, sem demonstrarem a presença de androgénios e estro genics nesta espécie, formularam a hipótese de certas substâncias, emitidas pelas gónadas, serem as responsáveis pela diferenciação do tracto genital, e ainda que as neurohormonas secretadas pelos gânglios cerebróides desempenhariam um papel importante na diferenciação das
gónaâas, como já tinha sido anteriormente referido (Streiff, H9ÓT; Le Breton, 1969; Lubet e Streiff, 1969).
A procura de esteróides foi iniciada bastante antes por uma tenta tiva feita por Steidl (1930) para demonstrar uma actividade estrogénica na Aply8Ía (gastrópode). Mais tarde, Gottfried e Losis (1966) identifi caram por cromatografia gasosa a 11cetotestosterona, a testosterona e a ITahidroxiprogesterona, a partir dos ovos de Avion ater, um outro gastrópode.
Se para esta classe os resultados se mostravam concordantes, o mesmo já não acontecia na classe dos lamelibrânquios, em que eram por vezes contraditórios.
Num estudo para tentar demonstrar a biossíntese de esteróides nos lamelibrânquios, De Longcamp et ai. (1970) descreveram a existência da 17BHSD nas gónadas de Mytilus edulis, responsável pela transformação da androstenediona em testosterona e viceversa. Constataram ainda a
ausência da Cw 2 Q^a s e pela nao transformação da 17cxhidroxiprogeste
rona em androstenediona.
Em 197^+ os mesmos autores, trabalhando com as gónadas masculina e feminina de Mytilus, e usando precursores radioactivos, demonstraram a existência de quatro sistemas enzimáticos: o complexo 3BHSD
A5' isomerase (pregnenolona »• progesterona, desidroepiandrostero
na ■+• androstenediona); a Cj^ 20~liase (l7ahidroxiprogesterona •*■
■*■ androstenediona); a 173HSD (desidroepiandrosterona ■>■ androstanediol,
androstenediona ^ testosterona, estradiol + estrona) e uma 5areductase (testosterona ■*■ 5ocdiidrotestosterona).
Um outro aspecto neste campo foi a comparação da composição de esteróides entre os gastrópodes e os lamelibrânquios, usando a cromato grafia gáslíquido. Theshima e Kanazawa (1972) verificaram que nos gas
trópodes, além de outros esteróides em C27 e C2g (b2 6h%), o coleste
rol era o esteróide que se encontrava em maior quantidade. Nos lameli brânquios a percentagem era inferior (26 35$), revelando ainda uma composição em esteróides muito complexa.
Passando para o estudo da bioconversão, estes mesmos autores, em 1973, injectaram 26 Cdesmosterol em Mytilus edulis e verificaram que
este possuía a capacidade de converter aquele composto em colesterol, 22-diidrocolesterol e 2Í4-metilenocolesterol, o que lhes permitia afir- mar que este lamelibranquio possui a a capacidade de sintetizar este- róides a partir de precursores, e que também o desmosterol, tal como acontecia nos vertebrados, era um intermediário na síntese do colesterol.
Para Walton e Pennock (1972) faltava ao Mytilus a capacidade de utilizar a 2- C-mevalonato como precursor na síntese de esteróides, mas Theshima e Kanazawa (1973) demonstraram que esta afirmação não era correcta, pois este animal tinha a capacidade de incorporar este com- posto na fracção esteróide.
Voogt (1975), ao estudar a possibilidade de síntese dos 33-esteróides em moluscos, demonstrou em alguns lamelibrânquios, como por exemplo a Anodonta cygnea, que após a injecção do 1- C-acetato este era incorporado na fracção esteróide em C2T , e ainda a alquilação a '-'28 e ^29"
Mas para além destes dados bioquímicos, também a presença de estruturas relacionadas com a síntese dos esteróides mereceu alguma atenção; neste sentido, Schoemmacker et ai. (1977) descreveram, não só a presença nos ovários da estrela-do-mar, Asterias rubens, da classe dos equinodermes, de células com as características das células produ- toras de esteróides, mas ainda que a actividade dessas células estava relacionada com a actividade da enzima 3&-HSD. Os mesmos autores, e ainda no mesmo animal, puseram em evidência a presença de uma 17a-hidroxilase, C-Ly_20-liase, 176-HSD, 20g-HSD, 2ia-hidroxilase e 5a-reductase, por incubação dos ovários e ceco pilórico com progeste- rona.
Todos estes trabalhos estabeleceram de uma maneira incontroversa a presença, quer das enzimas intervenientes na síntese e biotransformação dos esteróides, quer mesmo da presença de esteróides endógenos em alguns invertebrados.
0 nosso trabalho teve como objectivo integrar-se na sequência dos resultados descritos. Pretendemos assim demonstrar a existência de esteróides endógenos no lamelibrânquio Mytilus, que nos vertebrados têm
funções muito específicas na reprodução, como os progestagénios, os androgénios e os estrogénios.
Utilizando técnicas que nos permitiram uma boa purificação do extracto biológico, como a cromatografia em coluna e em camada fina, bem como técnicas de grande precisão analítica, como a cromatografia gás-líquido - espectrometria de massa, judemos identificar os este- róides xjrocurados, mesmo quando se encontravam em quantidades muito pequenas.
A presença da progesterona em quantidade que nos vertebrados é já considerada de interesse fisiológico (ng/g), e da androstenediona, um metabolito activo obtido a partir da progesterona, deram significado à presença de enzimas que anteriormente tinham sido postas em evidência.
A identificação da testosterona veio confirmar a hipótese, posta por Lubet, da existência deste esteróide na gónada masculina de
Mytilue.
No que respeita ao 17B-estradiol e à estrona, se bem que por
experiências in vivo tenha sido obtida a sua interconversão (estradiol + estrona), a confirmação como esteróides endógenos não tinha ainda sido feita, possivelmente porque as técnicas utilizadas não eram suficientemente sensíveis, ou então porque os animais foram estu- dados em épocas que nao correspondiam ao máximo do teor em esteróides.
Mais uma confirmação para estes resultados foi a caracterização de metabolitos destes esteróides, como a androsterona e o 5ot-androsta- nediol, a partir da androstenediona e da diidrotestosterona.
No final desta fase do nosso trabalho é possível afirmar a exis- tência destes esteróides em Mytilus, porque:
l2 - A separação efectuada por cromatografia troca iónica, permi-
tiu uma separação eficaz entre esteróides neutros e estrogé- nios;
22 - Por cromatografia em camada fina estes esteróides apresenta-
ram os mesmos R^ dos esteróides usados como referência;
32 - Por cromatografia gás-líquido estes esteróides apresentaram tempos de retenção idênticos aos dos esteróides de referên- cia;
i*2 - Por espectrometria de massa estes esteróides deram origem a
iam espectro idêntico ao dos esteróides de referência.
Mas para além da confirmação da existência dos esteróides endóge- nos, os valores encontrados permitem-nos avançar a hipótese da sua variação ao longo do ano, e mesmo uma relação com a fase do ciclo reprodutivo. A identificação de androgénios e estrogénios em Mytilus poderá não implicar, necessariamente, a acção destes esteróides como hormonas sexuais, e, mesmo desempenhando um papel na reprodução, não pretendemos concluir de imediato que ele seja idêntico ao desempenhado nos mamíferos.
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