Ao longo dos estudos efetuados com própolis de A. mellifera (Capítulos 6, 7 e 9) e T. angustula (Capítulo 8) foram coletadas amostras de outras abelhas nativas sem ferrão (inclusive de abelhas brasileiras aclimatadas em Portugal) porém em número insuficiente para permitir um estudo individual da própolis de cada tipo de abelha. Semelhanças entre os fingerprints obtidos por ESI(-)-MS das amostras de própolis de abelhas nativas com amostras cuja composição e/ou fontes vegetais foram determinados em trabalhos anteriores, nos permitiram estudar comparativamente estas variadas amostras de própolis, tomando em consideração a origem geográfica da amostra e o tipo de abelha da qual provinham. A identificação da espécie de abelha foi feita pelos apicultores e pesquisadores que forneceram as amostras.
Na Tabela 6 está uma lista das amostras de própolis brasileira usadas neste estudo. Duas colônias de abelhas nativas, das espécies Mellipona quadrifasciata e
Plebéia negriceps foram introduzidas e aclimatizadas a um zoológico de insetos na
região de Alentejo, Portugal, e amostras de sua própolis junto com uma amostra de própolis de A. mellifera oriunda do mesmo zoológico, foram fornecidas pelo proprietário
Tabela 6. Espécie de abelha e local de coleta da amostra de própolis analisadas no Capítulo 10.
Amostra Especie Coletada em: Região
Ta1 Tetragonisca angustula Cláudio, Minas Gerais sudeste
Ta2 Tetragonisca angustula Florianópolis, Santa Catarina sul
Ta3 Tetragonisca angustula Cruz das Almas, Bahia nordeste
Mq1 Melipona quadrifasciata Amazonas norte
Mq2 Melipona quadrifasciata Amazonas norte
Mq3 Melipona quadrifasciata Cruz das Almas, Bahia nordeste
Mq4 Melipona quadrifasciata Ribeirão Preto, São Paulo sudeste
Pr1 Plebeia remota Prudentopolis, Paraná sul
Pr2 Plebeia remota Prudentopolis, Paraná sul
Pr3 Plebeia remota Paraná sul
Pd Plebeia droryana Atibaia, São Paulo sudeste
Pd3 Plebeia droryana Ubatuba, São Paulo sudeste
Ps1 Plebeia sp. Paraná sul
Ps2 Plebeia sp. Itaparica, Bahia nordeste
Ls Lestrimelitta sp. Paraná sul
Tc Tetragona clavipes Paraná sul
Nt Nannotrigona testaceicornis Minas Gerais sudeste
Sb Scaptotrigona bipunctata Paraná sul
Ms1 Melipona scutellaris Bahia nordeste
Ms2 Melipona scutellaris Cruz das Almas, Bahia nordeste
Ms3 Melipona scutellaris Sauipe, Bahia nordeste
Ms4 Melipona scutellaris Amazonas norte
Mf Melipona favosa Corumbá, Mato Grosso do Sul centro-oeste
Am1 Apis mellifera Paraná sul
Am2 Apis mellifera Bahia nordeste
Am3 Apis mellifera Cruz das Almas, Bahia nordeste
Todas as amostras de própolis foram extraídas como descrito no item 5.4 e analisadas por ESI(-)-MS como descrito no item 5.1. Os extratos de própolis de abelhas nativas e de A. mellifera foram diluídos e inseridos diretamente no espectrômetro de massas Q-TOF da Micromass, obtendo-se espectros em modo negativo na faixa de 100 a 1000 m/z. Como não foram observados íons intensos com m/z acima de 610 os
A B 1 3 2 1 2 3
Figura 14. Análise por PCA dos 10 íons mais intensos de cada fingerprint ESI-MS em modo negativo das amostras de própolis de A. mellifera e abelhas nativas sem ferrão (siglas na Tabela 6): amostras agrupadas (A) e íons característicos para cada grupo (B). Os íons agrupados no centro da figura 14 B foram comuns a várias amostras.
A Figura 14 mostra a análise por PCA dos fingerprints ESI(-)-MS das amostras de própolis brasileira. Para este estudo foram usadas as intensidades relativas dos 10 íons mais intensos de cada amostra. Podemos observar que as amostras foram divididas em três grupos principais (Figura 14 A) correspondentes a íons característicos observados nos fingerprints (Figura 14 B). Uma análise detalhada destes íons nos permitiu identificar as fontes vegetais de dois grupos de amostras. A Figura 15 mostra
fingerprints ESI(-)-MS típicos de amostras de cada grupo, que serão discutidos a seguir.
O Grupo 1 é composto de 9 amostras de própolis sendo: três de T. angustula (Santa Catarina, Minas Gerais and Bahia); uma de Nannotrigona testaceicornis - Minas Gerais; uma de Plebeia sp. - Itaparica, Bahia; uma de Plebeia droryana - São Paulo; e três amostras provenientes do interior da Bahia (Cruz das Almas) sendo respectivamente: A. mellifera, Melipona scutellaris e M. quadrifasciata. A figura 15 mostra como exemplos típicos do grupo 1, fingerprints de T. angustula de Minas Gerais (Figura 15A) e de P. droryana de São Paulo (Figura 15B). Os íons de m/z 371, 373, 401, 455, 469 e 471 (Figura 14 B) que são diagnósticos destas amostras, são também característicos de própolis de T. angustula em todo o Brasil, e derivados de resinas de S. terebenthifolius, como determinado no Capítulo 8 [SAWAYA et al., 2006]. Referências foram encontradas ao fato de abelhas nativas visitarem intensamente esta árvore no sudeste [RAMALHO et al., 1990] e sul do Brasil [WILMS et al., 1997], embora não se soubesse se era para obter, pólen, néctar ou resinas. Tudo indica que as amostras de própolis do Grupo 1 usam como fonte vegetal principal as partes aéreas da árvore S. terebenthifolius, ou aroeira vermelha, que, devido a sua distribuição geográfica ampla, é usada como fonte vegetal em amostras de própolis no sul, sudeste e nordeste do Brasil.
O Grupo 2 também é composto de 9 amostras de própolis: duas de Plebeia
remota, uma cada de Plebeia sp., de LestrimelItta sp., de Tetragona clavipes, de Scaptotrigona bipunctata e de A. mellifera, todas do Paraná; e mais uma de Melipona favosa de Mato Grosso do Sul e uma de M. quadrifasciata de São Paulo. A figura 15 D
mostra um fingerprint de própolis de A. mellifera do Paraná e Figura 15 E um de P.
remota do Paraná, ambos típicos do Grupo 2. Os íons de m/z 301, 315, 317, 319, 333,
marrom de A.mellifera do sul do Brasil. Estes íons também foram encontrados em resinas de árvores do gênero Araucaria no Capítulo 7 e identificados por comparação dos ESI(-)-MS/MS das resinas e das amostras de própolis. A maioria das amostras do Grupo 2 provêem do estado do Paraná, onde estas árvores são comuns e estas resinas aparentemente são a principal fonte vegetal para própolis de abelhas nativas e A.
mellifera. Nos fingerprints das amostras de própolis do sul do Brasil encontramos
também os íons característicos de m/z 253, 255 (Figura 15 D and 15 E) que foram identificados como crisina e pinocembrina por ESI(-)-MS/MS, flavonóides característicos da própolis de A. mellifera do sul do Brasil, e de própolis européia (Capitulo 6). Não foi identificada a origem vegetal destes flavonóides no Brasil, mas é interessante notar que tanto as abelhas nativas (P. remota) como abelhas A. mellifera obtém resinas desta fonte vegetal. A amostra de própolis de P. remota do sul do Brasil (Figura 15 E) também contem compostos derivados S. terebenthifolius, observados na forma de íons de m/z 453 and 471 no seu fingerprint.
Duas amostras de própolis (P. droryana de São Paulo e P. remota do Paraná) foram colocadas entre Grupos 1 e 2 no PCA da Figura 14 A, o que indica que obtiveram suas resinas de ambas as fontes vegetais ; S. terebenthifolius e araucaria . A Figura 14 C mostra o fingerprint de uma destas amostras (P. droryana de São Paulo) onde são observados os íons de m/z 301 and 319 (característicos de araucaria) e os íons de m/z 373, 401, 455 and 471 (característicos de S. terebenthifolius).
Figura 15. Fingerprints ESI-MS em modo negativo de própolis de: (A) T. angustula / Minas Gerais - Grupo 1; (B) P. droryana / São Paulo – Grupo 1; (C) P. droryana/ São Paulo- entre Grupo 1 2 2; (D) A. mellifera / Paraná – Grupo 2; (E) P. remota / Paraná – Grupo 2; (F) M. quadrifasciata / Amazonas - Grupo 3 e (G) A. mellifera / Bahia – Grupo 3.
O Grupo 3 é composto de seis amostras de própolis: três de M. scutellaris da Bahia e Amazonas; duas de M. quadrifasciata de Amazonas e uma de A. mellifera do litoral da Bahia. O íon mais característico destas amostras é o de m/z 271 (Figura 14 B) encontrado anteriormente em própolis vermelha de A.mellifera do Nordeste do tipo R1 (Capítulo 6). Embora a fonte vegetal deste tipo de própolis ainda não foi determinada, a mesma espécie de planta é aparentemente usada por diversas espécies de abelhas na região norte e nordeste do Brasil. A Figura 15 F mostra o fingerprint ESI(-)-MS de uma amostra de própolis vermelha de A. mellifera da Bahia e a figura 15 G o de uma amostra de M. quadrifasciata do Amazonas onde o íon de m/z 271 é o mais intenso. Notamos também o íon de m/z 601, característico de própolis vermelha do litoral da Bahia (Figura 15 G), é observado com baixa intensidade em várias amostras de própolis de abelhas nativas
desse estado. Também observamos no fingerprint na Figura 15 F, íons menos intensos, porém característicos de S. terebenthifolius (m/z 373, 401, 453 e 469), indicando que até na região norte esta árvore é uma fonte vegetal importante para própolis de abelhas nativas. Estas observações a respeito da importância de S.
terebenthifolius como fonte vegetal de resinas para própolis de abelhas nativas condiz
com as informações obtidas no trabalho anterior (Capítulo 8) sobre a abelha nativa jataí, que usa esta planta para produzir própolis em todas as regiões pesquisadas.
A maioria dos fingerprints de própolis de abelhas nativas apresentou íons característicos de S. terebenthifolius, e somente três não apresentaram sequer traços desses íons (duas amostras de M. scutellaris de Bahia e Amazonas, e uma de S.
bipunctata do Paraná). Estes resultados são coerentes com os relatos de diversas
abelhas nativas visitando esta árvore [RAMALHO et al., 1990; WILMS et al., 1997]. Em regiões onde outras fontes vegetais estão presentes, as abelhas nativas se adaptam e podem usar também outras plantas (como araucaria no sul do Brasil).
No sudeste do Brasil, abelhas A. mellifera usam preferencialmente o arbusto
Baccharis dracunculifoia, como fonte vegetal para sua própolis, resultando na
conhecida própolis verde [BANKOVA et al.,1999a]. Os íons característicos de este tipo de própolis (Capítulo 6) não foram encontrados em nenhuma das amostras de própolis
de abelhas nativas analisadas, apesar de conter sítios fenólicos e ácidos e ionizarem fortemente em modo negativo. Portanto podemos concluir que B. dracunculifoia não é uma fonte vegetal para própolis de abelhas nativas.
A
B
C
Figura 16. Fingerprints ESI-MS em modo negativo de amostras de propolis de (A) A.
mellifera iberica (B) P. nigriceps and (C) M. quadrifasciata do zoológico de insetos em
A Figura 16 mostra os fingerprints das amostras de própolis de Portugal. A Figura 16 A mostra o fingerprint de própolis de A. mellifera, contendo íons característicos de própolis de países de clima temperado. Foram identificados por ESI(-)-MS/MS o éster prenilado do ácido cafeico (m/z 247) e vários flavonóides (m/z 253, 255, 269, 271 e 313) oriundos de árvores do gênero Populus, comuns na Europa [MAURI e PIETA, 2000]. O
fingerprint da amostra de própolis de M. quadrifasciata (Figura 16 C) mostra os mesmos
íons característicos, com intensidades similares, indicando que estas abelhas se adaptaram e estão usando resinas de árvores do gênero Populus para sua própolis. Já o fingerprint da amostra de própolis de P. nigriceps (Figura 16 B) mostra íons característicos de Populus menos intensos e íons mais intensos oriundos de outra fonte vegetal desconhecida. Estes resultados confirmam as observações feitas com as amostras de própolis brasileiras, onde vemos que abelhas de espécies diferentes podem preferir plantas diferentes como fontes de própolis dentro da mesma região. Por outro lado, o fato de abelhas nativas sem ferrão se adaptarem à vegetação de Portugal para obter resinas para sua própolis, demonstra a grande adaptabilidade destas abelhas nativas.
Os resultados deste estudo já foram aprovados para publicação: SAWAYA, A.C. H. F. , CUNHA, I. B. S., MARCUCCI. M. C., ADAIR, D. S., SILVA. E. C. A., CARVALHO, C. A. L., EBERLIN, M. N., Electrospray ionization mass spectrometry fingerprinting of propolis from native Brazilian stingless bees. Apidologie, 2006 in press.
11. CONCLUSÕES
Amostras de própolis de Apis mellifera de várias regiões do Brasil e de outros países foram analisadas por ESI-MS em modo positivo e negativo, observando que o
fingerprint das amostras, obtido por ESI-MS em modo negativo [ESI(-)-MS],
caracterizou claramente o tipo de própolis, podendo ser usado para a tipificação das amostras e a comparação de sua composição. Foi observada uma grande variabilidade na composição das amostras de própolis que era determinada pela origem geográfica das mesmas. As amostras provenientes de países de clima temperado (Europa e América do Norte) apresentaram fingerprints semelhantes, por ter composição similar e retirar suas resinas de árvores do Gênero Populus. Já as amostras brasileiras foram divididas em grupos de acordo com sua origem geográfica sendo dois grupos do nordeste, um do sudeste e dois do sul.
As amostras de própolis do sul e sudeste do Brasil já foram anteriormente estudadas e tipificadas. A comparação dos fingerprints por ESI(-)-MS de amostras de própolis de A. mellifera do sul e sudeste do Brasil os de extratos de plantas já citadas como sendo a fonte vegetal de suas resinas (Baccharis dracunculifolia e Araucária
heterophylla) permitiu confirmar a clara correlação do tipo de própolis com a planta
visitada para obter as resinas, demonstrando assim a utilidade de ESI-MS com injeção direta para este tipo de comparação. A análise das amostras de própolis e dos extratos de planta por HPLC-ESI-MS permitiu desenvolver uma lista com os espectros, adquiridos por ESI(-)-MS/MS, de vários compostos importantes da própolis destas regiões. Estas listas serão úteis para a identificação destes compostos em futuros estudos de própolis bem como em estudos de plantas medicinais e alimentos.
Aplicando a mesma metodologia para amostras de própolis de abelhas T.
angustula (oriundas do sul, sudeste e nordeste do Brasil) observou-se que, diferente
das abelhas A. mellifera, o fingerprint de suas amostras apresentou o mesmo perfil em todas regiões analisadas. Isto indica que estas abelhas são muito seletivas quanto à planta utilizada como fonte de resinas. A análise de extratos de plantas visitadas por T.
angustula resultou na identificação da planta, S. terebenthifolius, como principal fonte
vegetal para as resinas da própolis, em todas as regiões do Brasil analisadas. Os ácidos masticadienóico e masticadienólico, já identificados em extratos de S.
terebenthifolius foram identificados em própolis de jataí por ESI-MS de alta resolução.
Amostras de própolis de A.mellifera, proveniente de Cruz das Almas, Bahia, apresentaram fingerprints diferentes das outras amostras do nordeste, indicando que estas amostras têm composição diferente de outras amostras desta região e que sua composição varia sazonalmente. Os íons mais intensos observados nos fingerprints obtidos por ESI(-)-MS, principalmente nas amostras coletadas no segundo semestre, se assemelham àqueles observados em S. terebenthifolius indicando que as abelhas obtenham resinas desta árvore. Dois métodos para determinar atividade antioxidante diretamente em placas de TLC foram comparados, obtendo bons resultados com ambos.Três compostos com atividade antioxidante foram extraídos de placas de TLC preparativa e caracterizados por ESI(-)-MS/MS.
Amostras de própolis de várias espécies de abelhas nativas obtidas de todas as regiões do Brasil foram analisadas por ESI-MS em modo negativo e seus fingerprints foram comparados, permitindo a divisão das amostras em três grupos principais, correspondentes às plantas usadas como fontes vegetais das resinas. Amostras do sul do Brasil apresentaram íons diagnósticos de Araucária nos seus fingerprints. Amostras provenientes do sudeste e do interior do nordeste, bem como algumas amostras do sul apresentaram íons diagnósticos de S. terebenthifolius . Amostras provenientes do norte e do litoral do nordeste apresentaram íons diferentes, cuja fonte vegetal ainda não foi determinada, nos seus fingerprints. A maioria dos fingerprints de própolis de abelhas nativas apresentou íons característicos de S. terebenthifolius, enquanto somente três não apresentaram sequer traços desses íons, demonstrando a importância desta fonte vegetal para a própolis de abelhas nativas. Por outro lado, íons característicos de B.
dracunculifolia (principal fonte vegetal da própolis verde de A. mellifera) não foram
encontrados em nenhuma das amostras de própolis de abelhas nativas analisadas. Portanto, podemos concluir que B. dracunculifolia não é uma fonte vegetal para própolis de abelhas nativas.
A metodologia de ESI-MS fingerprinting, aqui desenvolvida, demonstrou ser rápida e confiável para a caracterização de amostras de própolis provenientes de abelhas diferentes e de origens geográficas diferentes. Esta metodologia também pode ser usada com segurança para a comparação de amostras de própolis e extratos de plantas para identificar fontes vegetais das amostras.
Acoplamento com HPLC é fácil e permite isolar e caracterizar compostos, formando bibliotecas de espectros ESI-MS/MS.
Futuramente ESI-MS fingerprinting poderá ser adaptada para o controle de qualidade e certificação de origem de produtos contendo própolis na sua formulação.
Anexo I
Estruturas de compostos encontrados em própolis brasileira.
HO O O HO HO O vanilina ác. p-cumárico HO O O OH OH O HO
3-metoxi-4-hidroxi-cinamaldeído ácido cafeico
O
HO O
HO O OH
O HO OH O O O OH HO propol viscidona O HO HO HO OH O HO O OH OH
ácido 3,4-dihidroxi-5-prenilcinâmico crisina
O OH HO O OH OH O OH HO O OH OH OH pinocembrina canferol
O HO O OH O HO O OH O
ácido 2,2-dimetil-8-prenil-2H-1-benzopirano-6-propenóico canferida
O HO HO OH O HO O OH O
ácido 3,5-diprenil-4-hidroxicinâmico dihidrocanferida
O HO O O O HO
O HO HO OH O HO O HO
ácido 4-hidroxi-3(E)-(4-hidroxi-3-metil-2-butenil) ácido 3-hidroxi-2,2-dimetil-8-prenil-
2H-1-benzopirano-6-propenóico -5-prenil cinâmico
O O OH O H OH O HO OH ácido agatálico ácido isocupréssico ácido cupréssico
O OH HO O OH O O O H O O H O
betuletol ácido agatálico
O H O O O OH O O O OH OH HO HO HO O HO O O
15 metil éster do ácido agático ácido 3-cafeoilquínico ácido 15-aceoxi-cupréssico
O
H O
O
O
O HO HO O O HO O O O OH OH O HO HO O HO HO ácido (E)-3-{-4-hidroxi-3-[(E)-4-(2,3- ácido 3,5- dicafeoilquínico
dihidrocinamoiloxi)-3-metil-2-butenil]- 5-prenil-fenil}-2-propenóico O O OH HO O OH
Anexo II
Cromatogramas Cap-LC-ESI-MS obtidos no equipamento Q-TOF, nas condições
descritas no item 5.2. Siglas: B1- própolis marrom do sul , B2- própolis mista do Paraná e G- propolis verde do sudeste.
Anexo III