Na década de 80, Carl Woese e colaboradores classificaram a subunidade menor do RNA ribossomal (16S) como sendo um marcador molecular poderoso a nível de identificação e classificação filogenético, desenvolvendo as primeiras árvores reflectindo a relação filogenética entre os procariotas baseadas na análise do 16S. Nos anos seguintes o desenvolvimento e
aplicação de técnicas de sequenciação de oligonucleotídeos e amplificação de DNA através da técnica de PCR expandiram drasticamente a base de dados de sequências de RNA (Strunk et
al., 2000). Através da comparação e análise das sequências de rRNA arquivadas e classificadas
na base de dados, uma pesquisa comparativa das potenciais zonas alvo permite efectuar o desenho de sondas específicas de determinado grupo, género ou espécie de microrganismos. Este facto, associado à existência de grandes quantidades de rRNA na maior parte das células, a aparente inexistência de transferência lateral de genes, a grande variedade de diferentes zonas específicas e com uma sequência estável, conferem boas razões para a utilização destes biopolimeros como molécula alvo no desenvolvimento de sondas de oligonucleotídeos (Woese, 1987). Uma sonda “standard” é constituída por um oligonucleotídeo com uma sequência, de tamanho variável entre 16-20 bases, complementar de determinada região especifica do RNA ribossomal alvo, à qual se encontra ligado um marcador fluorescente na extremidade 5’. Durante a hibridizacão as sondas entram nas células e ligam-se à sua sequência alvo (caso esta esteja presente), tornando a célula detectável por microscopia de epifluorescência devido à existência do marcador fluorescente. São vários os tipos de marcadores existentes, nomeadamente: fluoresceína (FLUOS), tetrametilrodamina, “texas red”, e os fluorocromos CY3, CY5 e CY7 (Amann et al., 1995). Devido à sua relativa fotoestabilidade o fluorocromo CY3 tornou-se o marcador mais usual melhorando as gamas de detecção FISH (fluorescent in situ hybridization) em amostras ambientais (Glöckner et al., 1996).
O uso de sondas de oligonucléotidos apresenta, no entanto, algumas limitações teóricas básicas inerentes à molécula alvo. O RNA ribossomal tem de se encontrar devidamente preservado de modo a possibilitar a correcta distinção entre populações intimamente relacionadas. A heterogeneidade por vezes existente entre operões de rRNA presentes no mesmo organismo (Mylvaganam & Dennis, 1992; Nübel et al., 1996), bem como a grande semelhança entre as sequências de 16S rRNA presente em espécies diferentes (Fox et al., 1992) podem conduzir a resultados erróneos.
Outra limitação advém do facto de que a diversidade do rRNA se encontra ainda parcialmente descrita (Amann et al., 1998). Mesmo que uma sonda seja desenhada para ser específica de uma determinada gama de microrganismos testados pode, contudo, hibridizar com organismos ainda não identificados que apresentam a mesma sequência alvo, ou não contabilizar os que não possuem zonas alvo com a complementaridade perfeita para a sonda, apesar de pertencentes ao mesmo grupo filogénico em estudo.
No desenho de sondas específicas para determinado grupo podem também surgir algumas limitações na determinação de uma zona alvo comum. Nestes casos, a população pode
ser monitorizada com mais de que uma sonda com diferentes marcadores, os quais permitem verificar a existência de “hibridização cruzada” nas populações presentes (Amann et al., 1996).
Há também que ter em conta que a especificidade e sensibilidade das sondas depende fortemente das condições exactas de hidridização (Stahl & Amann, 1991). Parâmetros tais como a temperatura de hibridização e lavagem, a concentração de catiões monovalentes e agentes desnaturantes têm de ser devidamente optimizados, de modo a garantir a suficiente permeabilização da célula e a acessibilidade da zona alvo. Só após verificação do seu correcto funcionamento e aplicabilidade na identificação dos organismos para os quais foi desenhada, esta pode ser aplicada com confiança em ambientes complexos (Amann, 1995).
Convém ainda referir a existência de uma certa imprecisão a nível quantitativo subjacente à impossibilidade do estabelecimento de uma relação directa entre a intensidade da hibridização e o número de células existente, uma vez que a quantidade de RNA celular depende do estado fisiológico da célula. Por outro lado, a contagem de células pode ser subestimada quando o conteúdo em RNA se encontra abaixo dos limites de detecção ou ocorrem limitações de permeabilidade celular (Amann et al., 1995). No entanto, dado que um aumento da actividade de uma determinada população se encontra directamente relacionado com um maior conteúdo de ribossoma celular e numero de células, a monitorização de parâmetros que sumarizem os dois efeitos poderá fornecer uma correlação razoável entre a dinâmica da população e uma determinada função, particularmente no estudo de ambientes complexos.
Actualmente só um número limitado de amostras pode ser processado com um grupo restricto de sondas. Automatização e paralelização de ensaios de hibridização é um objectivo para desenvolvimento futuro. O desenvolvimento da tecnologia de microarray/chips de DNA (Guschin et al., 1997) providenciará em breve a possibilidade de utilização de centenas a milhares de diferentes sondas numa única hibridização reversa (múltiplas sondas específicas para cada sequência de rRNA conhecida imobilizadas em determinado tipo de suporte), para aplicação a ambientes complexos de comunidades microbianas ambientais, o que possibilitará a obtenção de uma enorme quantidade de informação em simultâneo.
Uma outra tendência é o uso combinado da análise da composição da comunidade microbiana com sondas para o rRNA através da combinação da análise FISH com microsensores (Schramm et al., 1999) e microautorradiografia (Lee et al., 1999), possibilitando a
obtenção de importante informação a nível do ambiente físico-químico e gama de substratos utilizados para cada célula microbiana identificada.
Estudos combinados das comunidades a nível da estrutura/função das espécies microbianas presentes permitirão uma melhor compreensão das interacções entre as mesmas e com o seu ambiente biótico e abiótico independentemente de ser possível o seu cultivo.
A ecologia microbiana dos biofilmes e microbiologia ambiental avançou muito na década passada com o desenvolvimento de novas ferramentas moleculares e microscópicas, que permitiram aos investigadores caracterizar e localizar os microrganismos no seu ambiente, ultrapassando os limites subjacentes à inevitável selectividade dos métodos tradicionais cultivo- dependentes. Permitiram elucidar a diversidade de ecossistemas com grande complexidade de relações de competição e simbiose.