Os cromatogramas de íons totais (TIC) e os espectros de massas (Figs.33, 34 e 35) mostraram que na fração 3, há presença de dois sesquiterpenos: á - humuleno e de â-cariofileno (Fig.36) com 97% e 99% de semelhança no padrão de fragmentação em comparação com a biblitoteca do CG/EM. Dados de CG/EM da fração 3: α-humuleno (C15H24) IE m/z (int.rel.):
204(5), 147(22), 121(31), 107(18), 93(100), 80(32), 67(19), 53(12) e â-cariofileno (C15H24) IE m/z (int.rel.): 204(5), 189(12), 175(18), 161(28), 147(27), 141(0,5), 133(83), 127(1), 120(42),
111(2), 105(68), 93(100), 85(0,5), 79(85), 69(68), 63(2), 53(35), 41(93).
Rf=0,62
0
Fig.32: Bioautografia da fração 3, obtida de CCDP do ECHCl3
de raiz revelada com o fungo C. sphaerospermum. Sistema de eluição: CHCl3: MeOH (9:1).200µg. (7mg).
Fig.36: Substâncias com atividade antifúngica contra C. sphaerospermum presentes na fração 3 de raízes, (15) á- humuleno (C15H24) e (16) â-cariofileno (C15H24).
.
Fig.33: Cromatograma de íons totais (TIC) da fração 3 do ECHCl3 de raiz analisado
Fig.34: Espectro de massas:A-do componente da fração 3 do ECHCl3 de raízes de A. sidifolia
(Tr=11.692min), feito em CG-EM Agilent 5973 Network e B-do β-cariofileno
A
Fig.35: Espectro de massas A-do componente da fração 3 do ECHCl3 de raízes de A. sidifolia
(Tr=12.116min), feito em CG-EM Agilent 5973 Network e B-do α-humuleno
A
O EAcOEt de folhas apresentou atividade antifúngica contra C. sphaerospermum. Este extrato foi fracionado fornecendo o (Esquema 1, pág.33) flavonóide glicosilado quercitrina (Rf=0,63), que também apresentou atividade contra C. sphaerospermum, (Fig.37).
O diterpeno, corimbol, isolado do ECHCl3 de folhas, quando testado nas mesmas
condições, não apresentou atividade contra C. sphaerospermum.
Os EEtOH, EHid, EAcOEt e EHex de folhas de A. sidifolia apresentaram atividade antitumoral fraca contra as linhagens mutantes de S. cerevisae Rad 52Y com halo de inibição de 8 mm (atividade fraca). Estes mesmos extratos não apresentaram atividade antimicrobiana frente a Escherichia coli, Staphylococcus aureus e Candida albicans.
Rf= 0,63
0
Fig.37: Bioautografia do flavonóide (quercitrina) isolado do EAcOEt de folhas de A. sidifolia, revelada com o fungo C. sphaerospermum. Sistema de eluição: CHCl3:MeOH:H2O (64:36:8).200µg.
Alchornea sidifolia, planta nativa comum no PEFI, uma reserva de Mata Atlântica, foi
selecionada para estudo químico biomonitorado, através de uma triagem entre várias espécies de Euphorbiaceae, com o fungo Cladosporium sphareospermum (Leone et al., 2002).
Para este estudo, raízes, caules, folhas e flores da planta foram coletados no IBt. Os extratos etanólicos (raízes 0,28%, caules 0,68% e folhas 0,94%) obtidos seguindo a mesma metodologia e de acordo com a Fig. 8 (pág.18), foram particionados com solventes de polaridade crescentes (hexano, clorofórmio e acetato de etila) e os rendimentos de extrações foram diferentes. Os extratos de caules e folhas apresentaram massas relativas de 50% da parte menos polar e 50% da mais polar. A presença de óleo essencial não foi observada nas raízes, folhas e flores. Pode-se concluir que em Alchornea sidifolia não há presença de óleos essenciais.
Os resultados de bioautografia com o fungo C. sphaerospermum mostraram inibições mais nítidas no ECHC l3 dos caules (Figs.26 e 27) e das raízes (Fig.32). O fracionamento do
ECHCl3 dos caules, forneceu frações ativas cuja composição química é de difenilsulfeto e α-
amorfeno (Fig.31) e hidrocarbonetos. Nas raízes, os componentes majoritários da fração 3 ativa do ECHCl3 foram identificados como α-humuleno e β- cariofileno (Fig.36). A quercitrina
isolada do EAcOEt das folhas apresentou atividade antifúngica fraca contra C. sphaerospermum. Como relatado na literatura, sulfetos e polissulfetos são agentes antimicrobianos, inclusive alguns apresentam atividade contra C. sphaerospermum e C. cladosporioides (Benevides, 2001; Benevides et al., 2001). Da mesma maneira, os sesquiterpenos α-amorfeno, α-humuleno e β- cariofileno, presentes nos óleos essenciais de Annona cherimola (Annonaceae), apresentaram atividade antimicrobiana (Rios et al., 2003). A triagem fitoquímica de A. sidifolia para a caracterização de classes de substâncias, detectou a presença de terpenóides e flavonóides nos extratos e frações. O isolamento dos sesquiterpenos (Figs.31 e 36), corimbol (Fig.38) e quercitrina (Fig.13) confirmam esses dados de triagem. Neste mesmo estudo, a quantificação de fenóis totais nas folhas pelo método de Folin-Denis, foi de 32,6%, sendo que 22% destes fenóis
são flavonóides e 2,75% são taninos. Nos caules a porcentagem de fenóis totais foi de 9,8% sendo que 6% são flavonóides e 1,62% são taninos. Pode-se concluir que nas folhas há aproximadamente três vezes mais fenóis totais do que nos caules de A. sidifolia. A presença de maiores teores de substâncias fenólicas nas folhas de A. sidifolia pode estar associada a herbivoria e proteção contra a incidência de raios ultravioleta e visível (Harborne & Williams, 2000). Com relação a quercitrina, um flavonol glicosilado, comum em muitas famílias de plantas inclusive Euphorbiaceae também foi descrita atividade antimicrobiana (Penna et al. 2001). O diterpeno isolado das folhas, apresentou resposta negativa aos ensaios com o fungo C.
sphaerospermum.
Os EEtOH, EHid, EAcOEt e EHex de folhas de A. sidifolia apresentaram atividade seletiva contra a linhagem mutante de S. cerevisae Rad 52Y. Os halos de inibições observados para os extratos estudados foram de aproximadamente 8 mm (atividade fraca) uma vez que na concentração testada, o halo deveria ser de cerca de 12 mm para o extrato ser considerado ativo. Os extratos EEtOH, EHid, EAcOEt e EHex de folhas de A. sidifolia não foram ativos frente a
Escherichia coli, Staphylococcus aureus e Candida albicans.
O diterpeno isolado e identificado como corimbol, por métodos espectrométricos, inédito nesta espécie vegetal e que não apresentou atividade antifúngica, está sendo discutido porque alguns dados novos de espectrometria e complementares foram obtidos e auxiliaram na confirmação da estrutura proposta para o corimbol. Este diterpeno foi isolado primeiramente em
Turbina corymbosa (Convolvulaceae) (Pérezamador et al., 1965) e posteriormente em Calibrachoa parviflora (Solanaceae) (Elliger et al., 1992). Em espécies de Euphorbiaceae esta
substânc ia não havia sido isolada.
Com relação aos carbonos metilênicos C2 e C11 com deslocamentos químicos próximos 19.5 e 19.3 δ, respectivamente, as atribuições sugeridas foram feitas com base nas correlações (JCH e n=3) observadas no espectro de HMBC do C13 (46.4) com o H do C11 (1.54) como mostrado abaixo:
A estereoquímica relativa para o carbono C-6, semelhante ao corimbol, foi corroborada pelas medidas de constante de acoplamento do triplo dubleto (δ 3.75) com Jax-ax= 11.0 Hz e Jax-eq=3.5 Hz do hidrogênio carbinólico, observado no espectro de hidrogênio ampliado (Fig.19) (Elliger et al., 1992). Com estes dados pode-se confirmar que a estrutura proposta para o ppb é semelhante do corimbol (Fig.38-12). Na tabela 6 (pág.41) os carbonos C1 (CH2) e C10
(C), que estavam obscuros no espectro feito em DMSO-d6, foram atribuídos com base nos dados de RMN de 13C, DEPT 135º (Figs.21 e 22) e HMQC (Fig.23) cujos espectros foram feitos em CD3OD. Nesta tabela onde são comparados os valores de deslocamentos químicos do corimbol
(δ) e do ppb observa-se pequenas variações de δ que podem ser atribuídas ao efeito do solvente. O estudo químico de A. sidifolia, contribuiu para um melhor conhecimento do táxon e mostrou a importância da preservação e conservação da Mata Atlântica e seus remanescentes, que abrigam uma enorme “biblioteca” viva de moléculas e modelos bioativos, fruto de milhões de anos de evolução e adaptação (Rosenthal et al., 1979).
OH H OH H H H H 45.9 13 17 16 8 46.4 1.54 15 H C20H34O3
Fig.38: (12) Corimbol (ent-6β, 16α, 17- trihidroxicaurano )
6. RESUMO
Alchornea sidifolia, planta nativa da Mata Atlântica, foi selecionada para este estudo por
meio de uma triagem com várias espécies de Euphorbiaceae, coletadas na Reserva do PEFI, por apresentar atividade contra o fungo filamentoso Cladosporium sphaerospermum. Os objetivos deste trabalho foram: 1) o estudo químico monitorado por ensaios de atividade antifúngica com
C. sphaerospermum como fungo revelador, para identificação tanto de substâncias com potencial
atividade como de outros constituintes; 2) estabelecer relações químicas comparativas entre espécies do mesmo grupo taxonômico.
Para tanto, raízes, caules, folhas e flores da planta foram coletados no IBt. Os extratos etanólicos (raízes 0,28%, caules 0,68% e folhas 0,94%), obtidos do pó da planta foram particionados com solventes de polaridades crescentes (hexano, clorofórmio e acetato de etila) fornecendo os resíduos seguintes: caules 0,043% (EHex, 0,86g), 0,038% (ECHCl3, 0,752g),
0,24% (EAcOEt, 4,8g) e 0,32% (EHid, 6,34g); folhas 0,21% (EHex, 12,69g), 0,22% (ECHCl3,
13,37g), 0,097% (EAcOEt, 5,8g) e 0,41% (EHid, 24,3g); raízes 0,006% (EHex, 0,0587g), 0,013% (ECHCl3,0,136g), 0,0065% (EAcOEt, 0,0653g) e 0,165% (EHid,1,657g). A utilização
do método de Clevenger para a obtenção de óleos essenciais de raízes, folhas e flores mostrou-se ineficaz. A extração específica para alcalóides seguida de revelação com o reagente de Dragendorff apresentou resultados negativos para estes compostos.
A triagem fitoquímica de A. sidifolia para a caracterização de classes de substâncias, revelou a presença de terpenóides e de flavonóides nos extratos hexânico e de acetato de etila de folhas, respectivamente. O isolamento de sesquiterpenos, corimbol e quercitrina confirmam os dados da triagem fitoquímica. Neste mesmo estudo, a quantificação de fenóis totais nas folhas, pelo método de Folin-Denis, foi de 32,6%, sendo 22% de flavonóides e 2,75% de taninos. Nos caules, a porcentagem de fenóis totais foi de 9,8% sendo 6% de flavonóides e 1,62% de taninos. Estes dados sugerem que em A. sidifolia a presença de altos teores de fenóis nas folhas pode estar associada a herbivoria e proteção contra a incidência de raios ultravioleta e visível.
atividade seletiva contra a linhagem mutante de S. cerevisae Rad 52Y em comparação com a linhagem selvagem Rad+. Os halos de inibições observados para os extratos estudados foram de aproximadamente 8mm, atividade considerada muito fraca, uma vez que na concentração testada o halo deveria ser de pelo menos 12 mm, para o extrato ser considerado ativo. Os mesmos extratos acima citados, quando testados frente a Escherichia coli, Staphylococcus aureus e
Candida albicans não apresentaram atividade antimicrobiana.
Os resultados de bioautografia com o fungo C. sphaerospermum mostraram inibições mais nítidas nos extratos em CHCl3 dos caules e das raízes. O fracionamento do extrato CHCl3
dos caules, forneceu duas frações ativas, nas quais foram identificados por CG/EM difenilsulfeto, α-amorfeno e hidrocarbonetos. Nas raízes, os componentes majoritários da fração ativa foram identificados por CG/EM como α-humuleno e β- cariofileno. A quercitrina, isolada do resíduo AcOEt das folhas apresentou atividade antifúngica fraca contra C. sphaerospermum. O diterpeno ent-6β, 16α, 17- trihidroxicaurano, conhecido como corimbol, isolado do extrato clorofórmico de folhas e identificado, por métodos espectrométricos, é inédito nesta espécie vegetal e não apresentou atividade antifúngica.
7. ABSTRACT
Alchornea sidifolia, a native plant from the Rain Forest, was selected from a screening
for biological activities of Euphorbiaceae plants, collected in the Parque Estadual das Fontes do Ipiranga (PEFI), São Paulo, SP due to its activity against the filamentous fungus Cladosporium
sphaerospermum. This work describes the activity- guided fractionation of A. sidifolia extracts
using the C. sphaerospermum TLC bioautography.
The roots, stems and leaf crude ethanolic extracts were partitioned with hexane, chloroform, and ethyl acetate, respectively. The resulting solutions were concentrated in vacuo to afford the following extracts: stem 0,043% (EHex, 0,86g), 0,038% (ECHCl3, 0,752g), 0,24%
(EAcOEt, 4,8g) and 0,32% (EHid, 6,34g); leaves 0,21% (EHex, 12,69g), 0,22% (ECHCl3,
13,37g), 0,097% (EAcOEt, 5,8g) and 0,41% (EHid, 24,3g) and roots 0,006% (EHex, 0,0587g), 0,013% (ECHCl3,0,136g), 0,0065% (EAcOEt, 0,0653g) and 0,165% (EHid,1,657g).
Phytochemical screening with different detection methods reveled the presence of terpenes and flavonoids in both hexane and ethyl acetate extracts from the leaves of A. sidifolia. The isolation of sesquiterpenes, kaurenoid diterpene (corymbol) and quercitrin proved the nature of the constituents detected in the preliminary information. The amount of total phenol on the leaves according to the Folin- Denis method was 32,6%, from which 22% are flavonoids and 2,75% are tanins. For the stems, the percentage of total phenol was 9,8%, from which 6% are flavonoids and 1,62% are tanins. It has been admitted for a long time that phenols can act as a chemical barrier against herbivorous and protection against the ultraviolet rays. The high amount of phenols in A. sidifolia, may be associated to the ecological roles of these compounds.
EEtOH, EHid, EAcOEt and EHex extracts of the leaves of A. sidifolia had weak effect on DNA, as deduced by the selective inhibition zone (8mm) of the mutant strain Rad 52Y, relative to the wild strain Rad+. These extracts were evaluated for their activity against Escherichia coli,
sphaerospermum TLC biossay. Fractionation of the CHCl3 extract of stems was performed by a
combination of silica gel CC and TLC to give two active fractions. CG/MS analysis of these fractions showed the presence of diphenylsulfide, α-amorfene and hydrocarbons. Analysis of the CHCl3 extract of the roots by CG/MS showed the presence of two major components identified
as α-humulene and β- cariophyilene. The flavonoid quercitrin isolated from the AcOEt extract of the leaves presented weak antifungal activity against C. sphaerospermum. The diterpene ent-6β, 16α, 17- trihydroxykaurane, isolated from the chloroform extract of the leaves and identified by spectrometric methods as corymbol, did not show antifungal activity. This is e first report of corymbol in Euphorbiaceae.
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