Formação de estruturas amiloidogênicas

Essencialmente, a agregação de proteínas é uma associação de moléculas idênticas 72, agregados esses que podem ser classificados como ordenados e disordenados, com base em suas características 94.

Inúmeras patologias humanas estão relacionadas com o desenovelamento de proteínas, levando a conversão de cadeias polipeptídicas nativas a um estado fibrilar altamente organizado, ricos em folhas-β 92; 93. A formação desses amilóides é uma característica marcante dessas disordens neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer. Atualmente são descritas mais de 40 doenças relacionadas à presença de amilóides, cada qual tendo um padrão clínico distinto e associada à agregação predominante de um tipo específico de proteína 80.

Como foi identificada a presença de SEPT2 em emaranhados de neurofibrilas no cérebro com doença de Alzheimer 59, torna-se importante avaliar a propensão de SEPT2 para se organizar em estruturas amiloidogênicas, assim como realizar estudos estruturais para determinar as condições em que essas estruturas aparecem.

2.2.4.1 Programas de predição in silico

Atualmente existem alguns programas de predição da agregação de proteínas e de formação de estruturas amilóides, como TANGO, WALTZ e Zyggregator. TANGO é um algoritmo mecânico estatístico que faz predição da agregação de proteínas por suas folhas-β, com base nos princípios físico-químicos da formação de folhas-β 113; 114. WALTZ é um algoritmo que prediz regiões com alta probabilidade de formar filamentos amilóides, baseado na seqüência de aminoácidos, propriedades físicas e parâmetros estruturais 115. O Zyggregator, assim como o WALTZ, é utilizado para a predição de formação de amilóides em regiões específicas de uma proteína 116.

Assim, em uma análise preliminar, a seqüência de aminoácidos de SEPT2 foi submetida a esses programas de predição, a fim de analisar a propensão de SEPT2 para

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formar agregados em folhas β ou filamentos amiloidogênicos (http://tango.crg.es/, http://waltz.vub.ac.be/ and http://www-vendruscolo.ch.cam.ac.uk/zyggregator.php).

2.2.4.2 Desnaturação térmica

Como dito anteriormente, as estruturas amilóides são ricas em folhas-β, e apenas o desenovelamento parcial de uma região da proteína pode levar a formação dessas estruturas altamente organizadas 92; 93.

SEPT2 e SEPT2G (3 μM) foram incubadas nas temperaturas de 15ºC, 30ºC, 45ºC e 60ºC, durante 30 minutos. Após esse período de incubação, as proteínas foram acondicionadas em gelo e, então medidas. As análises de CD foram realizadas em um espectropolarímetro Jasco J-715 (Jasco Inc., Japão), utilizando uma cubeta cilíndrica de quartzo de 0,1 cm de caminho óptico. Os espectros foram coletados em uma faixa de comprimento de onda de 200-250 nm e uma média foi obtida a partir de 16 varreduras para cada espectro.

2.2.4.3 Análise do conteúdo de nucleotídeo

As septinas são proteínas ligantes de GTP e essa ligação confere estabilidade a essas proteínas 57; 117. No caso de SEPT4G, durante o desenovelamento térmico há a formação de um intermediário estrutural, responsável pela formação de estruturas amilóides, que não retém o nucleotídeo58.

Para analisar o conteúdo de nucleotídeo ligado a proteína após o aquecimento, SEPT2G foi incubada (3 mL a 5 μM) a 37°C e a 45°C por 90 minutos. Após esse tempo de incubação, as amostras foram concentradas em um concentrador Millipore (10 kDa), até restar um volume de 200 μL, que foi posteriormente completado com tampão para 3 mL. As amostras filtradas pelo concentrador foram analisadas em um espectrofotômetro U-2001 Hitachi, em um intervalo de comprimento de onda de 330 a 240 nm, já que o comprimento de

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onda de máxima absorção dos nucleotídeos contendo a base guanina é em 254 nm. Como controle negativo, o mesmo procedimento foi utilizado com SEPT2G mantida a 4 °C.

2.2.4.4 Espalhamento de luz a ângulo fixo

Com o intuito de estudar a cinética de agregação em função da temperatura, SEPT2 e SEPT2G (5 μM) foram centrifugadas (16.000xg por 10 minutos a 4ºC) e cada amostra foi colocada em uma cubeta de quartzo de 0,5 cm de caminho óptico. Utilizando um espectrofluorímetro modelo K2 ISS, equipado com um circulador refrigerado, as amostras foram iluminadas com luz de comprimento de onda de 350 nm e a intensidade do espalhamento foi coletada no mesmo comprimento de onda, em um ângulo fixo de 90º. Medidas foram feitas em 15ºC, 30ºC, 45ºC e 60ºC. Todas as medidas de intensidade foram dadas em unidades arbitrárias após subtração da luz espalhada pelo tampão. Os dados foram analisados usando o software Origin 7.0.

2.2.4.5 Espectroscopia de Fluorescência: Emissão de fluorescência do

fluoróforo Thioflavina-T (ThT)

Cada unidade constituinte da fibra amilóide (protofilamento) está arranjada de maneira que a cadeia polipeptídica forma uma folha-β, perpendicularmente ao eixo da fibra 78 (Figura 2.1 A). Essas fibras podem ser isoladas de pacientes com doenças neurodegenerativas ou podem ser produzidas in vitro, em condições semi desnaturantes 80. Para monitorar a formação dessa estrutura, utiliza-se a molécula fluorescente Thioflavina T (ThT) (Figura 2.1 B).

O ThT é um marcador clássico utilizado para visualizar placas compostas de β- amilóides encontradas em cérebros de pacientes com doença de Alzheimer. Quando o ThT liga nos oligômeros amilóides ele sofre uma alteração característica em seu espectro de emissão, que quando excitado em 450 nm, resulta em um sinal de fluorescência em 482 nm 118 _{(Figura 2.1 C).}

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Figura 2.1 - Marcador clássico para fibras amilóides. (A) Estrutura das fibras formadas pelo domínio C-

terminal (218-289) da proteína de fungo HET-s. O esquema mostra as 4 folhas-β em laranja, e a longa volta entre β2 e β3. Moléculas flanqueadoras ao longo do eixo da fibra são mostradas em

cinza 80_{; (B) Estrutura da molécula Tioflavina T. As dimensões estão indicadas na figura} 119_{; (C)}

Representação esquemática de uma folha-β. Os átomos da cadeia principal estão indicados como N, C e Cα, e as cadeias laterais por R. Ligações de Hidrogênio não são indicadas e o esquema é válido tanto para folhas-β paralelas e antiparalelas. O suposto canal de ligação do ThT está

indicado pela flecha de duas pontas 119_.

Utilizou-se um espectrofluorímetro modelo K2 ISS para as medidas de fluoresecência do ThT. As proteínas SEPT2 e SEPT2G em uma concentração de 5 μM foram usadas nesse experimento. As proteínas foram incubadas com 80 μM ThT e excitadas com um comprimento de onda de 450 nm, sendo a emissão monitorada em 482 nm. As medidas foram feitas em temperaturas de 15ºC, 30ºC, 45ºC e 60ºC e a emissão de fluorescência foi coletada em cada temperatura por 90 minutos. Alternativamente, também foram realizadas medidas a 4ºC durante 5 dias, apenas para SEPT2G.

2.2.4.6 Microscopia eletrônica de transmissão (MET)

Para caracterizar os agregados formados por SEPT2, a proteína foi incubada a 37°C por 30 minutos e a 4°C por cinco dias (alíquotas foram retiradas diariamente). As amostras

(B)

(C)

(A)

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foram aplicadas sobre um filme de carbono em “grades” próprias para a visualização na MET. As “grades”, com as amostras depositadas, foram então fixadas com acetato de uranila 1% filtrado e, consequentemente, lavadas para retirar o excesso do reagente. As imagens foram adquiridas com um Microscópio eletrônico de transmissão Philips CM 120, trabalhando a 80kV, no Laboratório de Caracterizações Estruturais (LCE), do DEMa-UFSCar, São Carlos, Brasil. Imagens adicionais foram feitas utilizando um Microscópio eletrônico de transmissão JEOL JEM 1230, 120 kV, no Centro de Investigações Biológicas, Madri, Espanha.