Formulação e otimização do meio

A composição do meio tem um efeito importantíssimo na taxa de crescimento. Os principais fatores que afetam a taxa de crescimento são as fontes de carbono e nitrogênio como também as vitaminas e alguns elementos limitantes como potássio e fósforo e minerais. As fontes de carbono mais utilizadas são glicose e sacarose. Outras de menor importância são hidrocarbonetos e dióxido de carbono. Um grande número de minerais é necessário para o crescimento, mas apenas em pequenas quantidades. Em alta quantidade podem atuar como inibidores.

O crescimento e a produção de metabólitos por microrganismos em um Bioprocesso são resultados de interações entre efeitos intra e extracelular conforme mostrado na Figura 2.2.

Célula Meio Reator

Processos de separação e purificação Produto Efeitos Extracelulares (Físicos) Efeitos Intracelulares Efeitos Extracelulares (Químicos)

Figura 2.2: Passos fundamentais de um Bioprocesso (adaptado de ASENJO e MERCHUK, 1994).

Os efeitos intracelulares são relacionados com os mecanismos de controle da replicação, transcrição e translação de informação genética. Já os efeitos extracelulares podem ser de natureza química ou física. Os parâmetros físicos são representados pela temperatura,

viscosidade, condições de agitação/ aeração, etc., e os químicos incluem todos os nutrientes utilizados.

Em um meio fisicamente e nutricionalmente apropriado uma cultura microbiana irá crescer a uma taxa definida e característica. Este crescimento se torna restrito com mudança no meio devido ao crescimento do microrganismo ou alterações externas com mudanças químicas ou físicas.

Os meios utilizados em Bioprocesso são agrupados em sintéticos ou complexos. Os meios sintéticos são aqueles em que os componentes são quimicamente definidos. Os meios complexos são os mais utilizados industrialmente, mas sua composição não é definida. Os passos para o desenvolvimento de meios de cultura sugeridos por ASENJO e MERCHUK (1994) são mostrados na Tabela 2.3.

Tabela 2.3: Passos e tópicos essenciais relacionados ao desenvolvimento de meio de cultura.

Passos Tópicos

“design” Requerimentos nutricionais para crescimento e formação de produto.

Outros aditivos.

Mecanismos bioquímicos.

Processos “Upstream” e “Downstream”. Bioviabilidade dos íons.

Custo, viabilidade e adequação dos substratos.

Formulação Composição de massa celular, estequiometria de crescimento e formação de produto.

Coeficientes de rendimento e outros parâmetros de fermentação.

Otimização Metodologias de otimização.

Dentre os requerimentos nutricionais para crescimento e formação de produto destacam-se macroelementos, microelementos, fatores de crescimento e influencia de fatores físicos. Não se deve esquecer que os requerimentos para se obter máximos rendimento e produtividade de metabólitos podem ser diferentes daqueles necessários para se obter máximo crescimento. Isto é válido principalmente para processos com crescimento não associado.

Os macroelementos são carbono, oxigênio, hidrogênio, enxofre, fósforo, potássio e magnésio. Constituem cerca de

90-95% do peso seco da massa microbiana. Os microelementos são geralmente adicionados na forma de sais sendo os principais Ca, Mn, Cu, Co e Zn. Fatores de crescimento são componentes necessários para o microrganismo, mas que este não consegue sintetizar, como exemplo pode-se citar alguns tipos de vitaminas e aminoácidos. Os principais fatores físicos a afetarem o meio de cultura são temperatura e atividade de água.

Em certos casos para se obter uma melhor produtividade, pode ser necessária a adição de agentes com funções específicas como quelantes, estimulantes, antiespuma, estabilizantes e neutralizantes.

O “design” do meio deve levar em conta também os passos ocorridos antes da fermentação (upstream) e logo após ela (dowstream). Na etapa anterior à fermentação, pode ser necessário um pré-tratamento de elementos que formarão o meio como a quebra de amidos, conversões e esterilização. Na esterilização com uso de calor, podem ocorrer reações indesejadas, como a de Maillard, como também a perda de atividade de elementos importantes como vitaminas. Somente com esta profunda análise se poderá ter uma informação real do meio. Os processos de separação e purificação posteriores à fermentação também irão sofrer influências dos componentes do meio de cultura utilizado. Por exemplo, a adição de um componente no meio pode aumentar o rendimento da fermentação, mas requerer um alto custo nos processos de separação e purificação inviabilizando seu uso.

O custo e um suplemento regular da fonte utilizada na fabricação do meio de cultura devem ser analisados e são de grande importância na adequação deste material ao processo. Alguns materiais podem ser sazonais necessitando de reserva estocada e requisitando estudos para condições ótimas de estocagem. Outras fontes têm composição variada dependendo do local onde foi produzida e quando foi. Estas considerações devem ser analisadas assim como o estudo de

fontes alternativas. Alguns aspectos importantes devem ser considerados na preparação do meio para fins comerciais. O ponto principal é assegurar a reprodutibilidade do meio. Sua composição deve ser sempre a mesma. Para isto deve-se:

Avaliar e considerar os efeitos de estocagem dos materiais utilizados na composição do meio.

Evitar a adição dos componentes em ordem errada.

Caso o meio contenha sólidos em suspensão é necessário preparar em um tanque separado, assegurar agitação adequada ao se transferir para o agitador.

Com relação à otimização do meio muitas metodologias podem ser aplicadas. As mais adequadas e rigorosas são baseadas em culturas contínuas e técnicas estatísticas.

2.1.3.

Cinética

Para se realizar o design de um processo biotecnológico é necessário saber a taxa com que ocorrem mudanças nas concentrações, por exemplo, de biomassa, substrato e produto. Os dados da cinética microbiana de crescimento, distribuição da população de células, síntese de produto e consumo de substrato são de grande importância na produção, controle e otimização do processo (ASENJO e MERCHUK, 1994). É importante saber também como o ambiente afeta a cinética. Em alguns casos o uso de modelos simplificados é suficiente para o design do sistema. Contudo, em outros pode ser vantajoso o uso de modelos mais sofisticados.