1. INTRODUÇÃO
2.4 FOSFOLIPASES D
As fosfolipases D (PLDs) catalisam a hidrolise da ponte fosfodiéster dos fosfolipídios, por exemplo, fosfatidilcolina, liberando a colina como subproduto.
Interessantemente todas as PLDs recombinantes de venenos encontradas pertencem às aranhas do gênero Loxosceles. As fosfolipases D são as enzimas mais estudadas e caracterizadas do veneno de Loxosceles spp e são consideradas como os principais componentes do veneno (de ANDRADE et al., 2005).
Essas enzimas possuem massa molecular média de 30 a 35 kDa, apresentam um peptídeo-sinal seguido de um propeptídeo e exibem alto grau de identidade de acordo com as sequencias amioácidicas, estando entre 55% e 99% da conservação dos resíduos no sítio catalítico. Baseado nos estudos filogenéticos as fosfolipases D foram distribuídas em seis grupos distintos dentro de uma mesma família que foi denominada Loxtox (CHAIM et al., 2006; KALAPOTHAKIS et al., 2007).
São também conhecidas como pertencentes da família das toxinas dermonecróticas, pois apresentam a principal participação na dermonecrose causada no quadro cutâneo do loxoscelismo (CUNHA et al., 2003).
Várias isoformas já foram expressas e caracterizadas tanto bioquimicamente como biologicamente e são capazes de reproduzir dermonecrose, resposta inflamatória e distúrbios renais em diferentes níveis devido às diferenças na atividade enzimática que cada isoforma apresenta, e boa parte destes trabalhos está presente na tabela ao final deste item.
Utilizando-se o método de análise proteômica no veneno total da L. gaucho, foi possível encontrar 11 isoformas de fosfolipase D (MACHADO et al., 2005).
Em 2010 Gremski e seus colaboradores fizeram a análise proteômica do veneno total da L. intermedia. Este estudo mostrou que 20,2% dos transcritos codificantes para toxinas pertenciam a PLDs.
As fosfolipases D, anteriormente conhecidas como esfingomielinases D, como o nome já sugere também apresentam atividade esfingomielinásica e são capazes de causar agregação plaquetária, hemólise, letalidade, nefrotoxicidade e hiperpermeabilidade vascular (TAMBOURGI et al., 1998; da SILVA et al., 2004;
KALAPOTHAKIS et al., 2007; RATTMANN et al., 2008).
A principal importância da atividade catalítica das fosfolipases D se deve ao metabolismo da esfingomielina e acredita-se que os metabólitos gerados possam modular uma variedade de eventos biológicos, que englobam desde a proliferação e
diferenciação celular até fenômenos de apoptose (MARCHESINI, HANNUN, 2004;
TANI, ITO, IGARASHI, 2007).
Dentre todos os trabalhos listados na tabela abaixo o que mais chamou a atenção foi o do CATALÁN e seus colaboradores (2011), por afirmar a clonagem e expressão de uma isoforma de fosfolipase D de Loxosceles laeta inativa. Neste trabalho duas isoformas foram clonadas e expressadas e foram chamadas de rLIPLD1 e rLIPLD2 sendo a segunda a toxina teoricamente ativa, não fosse o fato de que uma importante parte já conhecida das fosfolipases D estivesse claramente omitida na sequência desta toxina recombinante.
Já foi reportado por MURAKAMI e colaboradores (2006) que o aminoácido Histidina da posição 12 tem papel importante na atividade catalítica das fosfolipases D das aranhas do gênero Loxosceles. O aminoácido Histidina na posição 47 participa no ataque nucléofilo atacando a ligação fosfodiéster do substrato. A Histidina da posição 12 doa um átomo de hidrogênio para o substrato intermediário penta-coordenado gerado, formando a colina. A Histidina 12 então desprotonada retira um próton de uma molécula de água, num segundo ataque nucleófilo sobre este intermediário da reação, formando e liberando a então ceramida-1-fosfato como subproduto da reação.
Numa rápida olhada nas sequências depositadas por CATALÁN e colaboradores (2011) sob os números de acesso no GenBank GU121905 e GU121906, ou mesmo no próprio trabalho publicado,é possível notar que a segunda isoforma (rLIPLD2) não possui o aminoácido Histidina da posição 12, nem os aminoácidos precursores.
Ficando assim claro o motivo pelo qual está isoforma não possui atividade catalítica hidrolítica como as outras isoformas de fosfolipases das aranhas do gênero Loxosceles.
Em KUSMA e colaboradores (2008) é reportada no trabalho a produção de uma forma recombinante da isoforma LiRecDT1 da aranha Loxosceles intermedia com uma mutação sítio-dirigido na Histidina da posição número 12, substituindo pelo aminoácido Alanina. A então proteína recombinante mutada LiRecDT1 H12A mostrou em ensaios realizados possuir sua atividade catalítica praticamente anulada, corroborando com a hipótese sugerida por MURAKAMI e colaboradores (2005) sobre a importância deste aminoácido na atividade destas toxinas dermonecróticas.
Em todos os trabalhos listados na tabela abaixo (tab. 3) houve a produção da toxina recombinante na sua forma solúvel. O uso da bactéria E. coli foi unânime e a cepa BL21(DE3) e BL21(DE3)pLysS foram as mais utilizadas, com apenas um trabalho relatando o uso da cepa E. coli BL21trxB-DE3, a cepa E. coli SHuffle Express T7 LysY (VIUTIKA 2012) e outro (KALAPOTHAKIS et al., 2002) onde não é possível saber qual cepa foi utilizada pois não é informado.
CHAIM e seus colaboradores (2011) propuseram possíveis e promissoras aplicações biotecnológicas para as fosfolipases-D presentes no veneno da Loxosceles intermedia, já clonadas, expressadas e caracterizadas pelo grupo.
Essas sugestões são favorecidas devido ao grande acumulo de conhecimento das propriedades estruturais, bioquímicas e biológicas das fosfolipases-D, podendo ser empregadas em estudos de desenvolvimento de novas drogas, biofármacos, testes diagnósticos e outras aplicações industriais (CHAIM et al., 2011b).
Dentre as propostas está o desenvolvimento de uma vacina derivada da fosfolipase-D mutada LiRecDT1H12A (KUSMA et al., 2008) para a imunização de pessoas vivendo em regiões onde os acidentes envolvendo aranhas do gênero Loxosceles são endêmicos. A produção de reagentes para ensaios imunodiagnósticos para a identificação e quantificação de fosfolipases-D no soro de pacientes picados pelas aranhas do gênero Loxosceles também é sugerida, embasada na forte argumentação de que os diagnósticos oferecidos atualmente são passiveis de controvérsias, e são comumente baseados em sinais clínicos e nos sintomas apresentados. Outras duas propostas são, o uso em protocolos de lipídios para estudos de membranas celulares relacionados aos efeitos biológicos dos metabólitos lipídicos e a produção de novos agentes antitumorais baseados na fosfolipases-D das aranhas do gênero Loxosceles, pois já foi demonstrado que em certos tipos de tumores a atividade e expressão de algumas fosfolipases esta aumentada.
A produção de isoformas mais ativas seria de grande valia para o uso em alguns dos estudos propostos por CHAIM e colaboradores (2011), para tanto, mais estudos estruturais das fosfolipases-D precisão ser conduzidos para que se possa saber com propriedade o papel que cada resíduo desencadeia na estrutura da toxina e para que assim seja possível, através de modificações planejadas, produzir novas formas recombinantes com aplicações biotecnológicas nos mais diversos segmentos, seja
nas já previamente propostas ou em novas possibilidades que surgirem no decorrer dos estudos.
Kalapothakis et al., 2002 Loxosceles
intermedia recLiD1 37 kDa
pBK-CMV E. coli*
37 °C, D600 de 0.5, 0.5 mM de IPTG por 8h-12h. Coluna Sephacryl S-200, ELISA e
purificação usando coluna de afinidade 8h-12h. Coluna Sephacryl S-200, ELISA e
purificação usando coluna de afinidade
Lee e Linch 2005 Loxosceles reclusa SMaseD e
mutantes 42kDa pET30 E. coli
BL21(DE3)pLysS
1.0 mM de IPTG. Purificação com coluna de ligação Niquel Sepharose e S-protein
agarose.
de Andrade et al., 2006 Loxosceles
intermedia P1 e P2 37kDa,
intermedia LiRecDT1 34kDa pET-14b E. coli
BL21(DE3)pLysS
D550 de 0.5, 0.05 mM de IPTG por 3.5h à 30°C. Purificação usando coluna de
Ni-NTA agarose.
da Silveira et al., 2006 Loxosceles intermedia
Autor Espécie Nome Massa ~ Vetor Cepa de expressão Protocolo expressão e purificação
Felicori et al., 2006 Dias-Lopes et al., 2010
Loxosceles
intermedia recLiD1 32.7kDa pET11a E. coli BL21 (DE3)
D600 de 0.5, 0.5 mM de IPTG por 4h à 37
°C. Purificação em cromatografia de fase-reversa (HPLC) usando coluna C8 Vydac.
Olvera et al., 2006
100 uM IPTG por 16h à 20°C. Purificação usando coluna de afinidade
Ni-NTA-Sepharose.
da Silveira et al., 2007 Loxosceles intermedia
Ribeiro et al., 2007 Loxosceles intermedia
Appel et al., 2008 Loxosceles
intermedia LiRecDT6 33 kDa pET-14b E. coli
de Saint Ferrara et al., 2009 Loxosceles laeta Smase I e SMase II
Catalán et al., 2011 Loxosceles laeta rLlPLD1 e rLlPLD2
Autor Espécie Nome Massa ~ Vetor Cepa de expressão Protocolo expressão e purificação
Chaves-Moreira et al., 2011 Loxosceles intermedia fase-reversa (HPLC) usando coluna C8 Vydac.
Vuitika 2012** Loxosceles
intermedia LiRecDT7 34.4kDa pET-14b E. coli SHuffle T7 Express LysY
D600 de 0.4 – 0,6, 0.05 mM de IPTG por 4h à 30°C. Purificação usando coluna de
Ni-NTA agarose.
Tabela 3 - FOSFOLIPASES D RECOMBINANTES encontradas na literatura disponível no site do Pubmed. * Não foi informada qual a cepa de Escherichia coli foi utilizada. **Dissertação de mestrado, trabalho não publicado.
3 CONCLUSÃO
Durante toda a pesquisa por artigos publicados referentes à fosfolipases (A1, A2, B, C e D) recombinantes de venenos foi indiscutivelmente perceptível como a maneira da escrita dos primeiros artigos em cada grupo ditou de certa forma os trabalhos posteriores, sejam este dos mesmos grupos de pesquisa ou de outros.
Digo isso, pois, ao elaborar as tabelas para cada grupo de fosfolipases, algumas lacunas foram mais trabalhosas enquanto que em outros casos foram de fácil compreensão e, portanto, rápido preenchimento.
Informações como, por exemplo, temperaturas de expressão dificilmente são encontradas nos artigos relacionados às fosfolipases A2, enquanto que por outro lado tal informação é facilmente obtida em todos os artigos publicados sobre fosfolipases D recombinantes. Devido à pequena quantidade de artigos sobre fosfolipases A1 recombinantes de venenos, a mesma avaliação torna-se inviável, portanto não adentrando nesta observação.
O pesquisador ou laboratório que desejar trabalhar com fosfolipases A1 de venenos, com o intuito de produzi-las de forma recombinante, aparentemente terá como desafio pela frente o fato destas enzimas terem se mostrado tóxicas para os organismos quando expressas. Porém isto se aplica se o sistema de expressão utilizado for o bacteriano ou as leveduras, pois Seismann e seus colaboradores (2010) obtiveram sucesso com a expressão de fosfolipases A1 em células de inseto, onde estas não sofreram o efeito tóxico relatado nos outros sistemas de expressão.
Embora tóxicas para as bactérias e leveduras, as fosfolipases A1 recombinantes foram obtidas pelos pesquisadores e utilizadas nos seus trabalhos.
As fosfolipases A2 são de longe as fosfolipases de veneno mais estudadas. O que mais chama atenção nos trabalhos com a expressão de suas formas recombinantes seja estas semelhantes às selvagens ou as suas formas mutadas, é o fato de quase todos os trabalhos tiveram problemas com a produção destas enzimas em corpos de inclusão. Entretanto, todos os grupos obtiveram estas enzimas solúveis e ativas para utilização nos estudos conduzidos, após passarem, por exemplo, por algumas etapas como refolding, ativação e purificação.
As fosfolipases B de venenos são interessantes pelo fato de pouco se ter sobre estas enzimas disponíveis em artigos. É instigante o fato de se saber que este
campo ainda está aberto para ser explorado pelos pesquisadores e mais instigante o fato de não ser encontrado na literatura trabalho com suas produções de forma recombinante. Ficando aqui a dica para este campo aberto para ser desvendando pelos pesquisadores.
Até a presente data não se foi confirmada a presença de fosfolipases C como componentes de algum veneno já pesquisado. Pode ser que realmente essas enzimas não existam sobre esta forma em venenos, como também pode ser que daqui algum tempo veremos a primeira descrição dessa enzima em algum veneno já conhecido ou até mesmo ainda não pesquisado, deixando aqui outra brecha para os pesquisadores.
Sobre as fosfolipases D, com certeza o mais marcante é o fato de todos os trabalhos com fosfolipases D recombinantes de veneno ser proveniente do mesmo gênero de aranhas, as Loxosceles. Iniciando pelo trabalho de Kalapothakis e seus colaboradores (2002) e a partir de então surgindo diversos trabalhos com a produção recombinante destas enzimas. Tudo isso tendo iniciado com o intuito de entender melhor o “Loxoscelismo” decorrente da picada das aranhas deste gênero, e hoje vemos a abrangência dos trabalhos para os estudos destas enzimas como ótimas candidatas a ferramentas biotecnológicas. O pesquisador que desejar trabalhar com estas enzimas terá uma boa lista de referências a seguir e dificilmente terá dificuldades para expressão destas enzimas de forma recombinante, devido ao grande aporte de informação disponível nos diversos trabalhos relacionados, todos utilizando a bactéria E. coli como sistema de expressão.
De modo geral, a bactéria E. coli é o sistema de expressão mais utilizado para produção de fosfolipases de veneno recombinantes, seguido das leveduras e em menor quantidade as células de inseto.
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