Fosfolipases-D (PLDs)

Entre os organismos vivos que produzem fosfolipases-D, as aranhas do

gênero Loxosceles são notáveis em produzir uma mistura de isoformas destas

moléculas em seus venenos (da SILVA et al., 2004, KALAPOTHAKIS et al.,

2007). As fosfolipases-D dos venenos loxoscélicos, também conhecidas como

toxinas dermonecróticas, são as principais responsáveis pelo desenvolvimento da

lesão dermonecrótica nos acidentados, principal evento do loxoscelismo (da

SILVA et al., 2004, APPEL et al., 2005, SWANSON e VETTER, 2006).

Essas enzimas catalisam a hidrólise de fosfolipídios como esfingomielina na

ligação fosfodiéster terminal para liberar colina e produzir ceramida 1-fosfato

(C1P) e também fosfatidilcolina de uma maneira dependente de íon Mg

(da

SILVA et al., 2004; van MEETEREN et al., 2004; CHAIM et al., 2011b; HORTA et

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Gremski e colaboradores (2010) revelaram que no transcriptoma da glândula

de veneno de L. intermedia 9% dos transcritos analisados correspondem a

fosfolipases-D. Estes dados estão de acordo com os descritos por Machado e

colaboradores (2005), que identificaram pelo menos 11 isoformas de PLD no

veneno de L. gaucho, denominadas Loxonecroginas, ou dados relatados por

WILLE et al., (2013), que por eletroforese bidimensional seguido por imunoblotting

encontraram no veneno de L. intermedia pelo menos 25 spots imunologicamente

relacionados com as toxinas PLDs.

Estas toxinas são proteínas com massa molecular de 30 a 35kDa, que

contém de 284 a 285 aminoácidos e incluem um peptídeo sinal seguido por um

pró-peptídeo. Apresentam uma única cadeia polipeptídica que dobra-se para

formar um barril distorcido onde a superfície interna do barril é revestida com oito

folhas β paralelas (denominadas A-H) e por oito α-hélices (denominadas de

hélices 1-8) que formam a superfície externa do barril (MURAKAMI et al., 2005).

Este motivo estrutural foi observado pela primeira vez na estrutura da Triose

Fosfato Isomerase (TIM) e é referido como um barril TIM ou como um barril

(α/β)8. Estas enzimas apresentam um loop catalítico (azul), um loop variável

(verde), um loop flexível (vermelho) e outros loops curtos que cercam o sítio ativo

(Figura 7A). O loop catalítico contém um resíduo catalítico importante, a

His47, que forma um gancho, devido à presença de uma ponte dissulfeto

(Cys51-Cys57).

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Figura 7: Estrutura de fosfolipases-D de aranhas do gênero Loxosceles. (A) Alinhamento estrutural entre a LiRecDT1 de Loxosceles intermedia (classe II) e a PLDI de Loxosceles laeta. Os loops catalíticos estão coloridos em azul, loops flexíveis em vermelho, loops variáveis em verde (Modificado à partir de GIUSEPPE et al., 2011). (B) Diferenças entre os aminoácidos do sítio ativo da PLD classe IIa (átomos em branco) e classe IIb (átomos em amarelo). Observar a presença do átomo de Mg2+ no sítio catalítico. Modificado a partir de MURAKAMI et al., 2006, CHAVES-MOREIRA, 2011.

As sequências de aminoácidos das fosfolipases-D são altamente

conservadas (55 a 99%), especialmente nos resíduos próximos a fenda catalítica,

no entanto, essas enzimas podem ser agrupadas em duas classes com base na

sua sequência, estruturas e dados bioqímicos (MURAKAMI et al., 2006, de

GIUSEPPE et al., 2011). A classe I representada pela PLDI de L. laeta é

caracterizada pela presença de apenas uma ponte dissulfeto (Cys-51-Cys57) e

um circuito hidrofóbico variável (loop variável). Já a classe II compreende PLDs

que contêm uma ponte dissulfeto adicional (Cys53-Cys201) intra-cadeia adicional

ligando o loop flexível ao loop catalítico. A classe II pode ser subdividida em duas

classes dependendo da sua capacidade de hidrolisar esfingomielina, classe IIa

(maior atividade catalítica) e IIb (menos ativa ou inativa) (MURAKAMI et al., 2005,

de ANDRADE et al., 2006, MURAKAMI et al., 2006) (Figuras 7A e 7B).

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O íon Mg

é essencial para a atividade catalítica dessas moléculas e seu

sítio de ligação é completamente conservado em todas as fosfolipases-D do

veneno de aranha marrom. Este íon é octaedricamente coordenado (com uma

significativa distância média Mg

-O de 1,98 Å), equatorialmente por oxigênios

carboxilados nas cadeias laterais de Glu

e Asp

e por duas moléculas de água

fortemente ligadas e apicalmente por átomos de oxigênio carboxilados de cadeias

laterais de Asp

e por uma molécula de água que é também ligada ao átomo de

hidrogênio do Glu

O

. A estrutura da enzima é determinada pela presença da

ligação de um íon sulfato, o qual é considerado por ocupar a metade da posição

fosfato do substrato e é coordenado por três moléculas de água, duas das quais

também coordenam o íon Mg

. O anel indol de Trp

é parcialmente

desordenado e provavelmente desempenha um papel na estabilização do grupo

de cabeça de colina do substrato (MURAKAMI et al., 2005).

Com base na estrutura do cristal da fosfolipase D, foi sugerido um

mecanismo catalítico dividido em dois passos nos quais His12 e His47

desempenham importantes funções. No primeiro passo a His12 atua como um

nucleófilo que inicia o ataque sobre o substrato no ponto de quebra da ligação, o

qual é seguido pela formação de um intermediário penta-coordenado que

posteriormente é desestabilizado pela doação de um átomo de hidrogênio pela

His47, levando à formação de uma molécula de colina. Em um Segundo passo da

reação a His47 retira um próton da molécula de água o que inicia o ataque

nucleófilo sobre o estado intermediário covalente da histidina resultando na

formação de um segundo produto ceramida 1-fosfato, e o retorno para o estado

inicial. O íon Mg

é importante para o reconhecimento e ligação do substrato e

para uma estabilização adicional do estado intermediário do mecanismo catalítico

de dois passos (MURAKAMI et al., 2006) (Figura 8).

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Figura 8: Mecanismo catalítico da fosfolipase-D. Hidrólise de esfingomielina envolvendo duas histidinas (His 12 e His47) encontradas no sítio catalítico da enzima. Adaptado de MURAKAMI et al., 2006.

Muitas isoformas de PLD do veneno de espécies de Loxosceles foram bem

caracterizadas e clonadas (RAMOS-CERRILLO et al., 2004, BARBARO et al.,

2005, MAGALHÃES et al., 2013). No veneno de L. intermedia, muitas isoformas

de PLD têm sido descritas e destas nove isoformas já foram expressas como

proteínas recombinantes. São capazes de reproduzir a maioria dos efeitos tóxicos

observados no loxoscelismo e as propriedades antigênicas do veneno

(KALAPOTHAKIS et al., 2002, FERNANDES-PEDROSA et al., 2002, CHAIM et

al., 2006; da SILVEIRA et al., 2006, da SILVEIRA et al., 2007a, APPEL et al.,

2008, VUITIKA et al., 2013). Tanto as formas nativas quanto as recombinantes

tem sido relatadas no desenvolvimento de lesões dermonecróticas, aumento da

permeabilidade vascular, aumento da resposta inflamatória no local de inoculação

e em nível sistêmico, agregação plaquetária, hemólise, nefrotoxicidade e

letalidade (CUNHA et al., 2003, APPEL et al., 2005, SWANSON e VETTER, 2006,

SENFF-RIBEIRO et al., 2008; TAMBOURGI et al., 2010, CHAIM et al., 2011b).

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