Fotobioestimulação em cultura de células ósseas

Ozawa et al. (1998), sugeriram que, in vitro, o laser induz a formação de nódulos mineralizados e a diferenciação de células imaturas da linhagem osteoblástica, porém esses efeitos podem não ser encontrados em células maduras. Um dos relatos precursores da capacidade do laser (He-Ne, λ 632,8 nm, 10 mW, 180 mW/cm²; 1,43 J/cm²) em interagir com as células ósseas humanas in vitro, foi descrito por Stein et al. (2005), onde após a comprovação houve a suposição da possibilidade do incremento do reparo ósseo clinicamente em humanos. Outros trabalhos com células ósseas irradiadas com laser já relataram o aumento na produção de fosfatase alcalina (OZAWA et al., 1998; STEIN et al., 2005), síntese de osteocalcina (OZAWA et al., 1998; KHADRA et al., 2005) e osteopontina e sialoproteína óssea (STEIN et al., 2005), aumento expressivo na adesão e viabilidade dos osteoblastos (FUJIHARA; HIRAKI; MARQUES, 2006), bem como a produção de nódulos mineralizados (OZAWA et al., 1998; DÖRTBUDAK; HAAS; MALLATH-POKORNY, 2000; KHADRA et al., 2005; AMID et al., 2014). E o LED, também em células de linhagem óssea, já demonstrou o aumento da viabilidade celular (PAGIN et al., 2014). Demonstrando a importância do conhecimento dos efeitos do Laser e LED na unidade básica celular, para que a partir da observação desses os melhores parâmetros possam ser empregados com maior segurança. Maiores detalhes e outros relatos que utilizaram a fotobioestimulação em células ósseas podem ser observados a seguir (QUADRO 1).

Além dos achados e eventos demonstrados a nível celular por inúmeros estudos, algumas revisões sistemáticas visam entender melhor os efeitos da fotobioestimulação e por isso os estudos in vitro tem grande importância na construção desse conhecimento. A partir das revisões foi observado que a fotobioestimulação em diferentes linhagens celulares foi capaz de aumentar a viabilidade celular, síntese de DNA, RNA e produção de colágeno, inclusive estimulando o início da mitose celular. A fotobioestimulação excita os fotorreceptores presentes nas estruturas e organelas

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celulares, convertendo a luz em energia química através da formação de ATP o que aumenta as taxas de função e viabilidade celular (ALGHAMDI; KUMAR; MOUSSA, 2012). As cascatas de eventos gerados nas células a partir da fotobioestimulação são amplamente estudadas. Em relação ao tecido ósseo e seu reparo foi observado que o laser é capaz de estimular a viabilidade e diferenciação de osteoblastos repercutindo no aumento da expressão da atividade da fosfatase alcalina e produção de nódulos mineralizados, na síntese de colágeno tipo I, osteopontina e sialoproteínas ósseas. Dependendo da dose empregada há o incremento da TGFβ1 e redução do número de osteoclastos, com aumento e diferenciação de osteoblastos, porém esse mecanismo não é completamente entendido (WU; XING, 2014).

Marcadores genéticos ósseos interagem com os estímulos luminosos, como é o caso do fator de transcriptase reversa 2 (Runx2) desencadeando algumas cascatas de sinalização (ERK 1/2) e de ativação de quinases (PI3K/p21 e PAK1) (ROLA; DOROSZKO; DERKACZ, 2014). É sugerido que o laser também ative a liberação do fator de crescimento semelhante a insulina tipo 1, nos osteoblastos, além de BMPs, mediadores que fazem o transporte de proteínas nos fluidos sanguíneos para a região onde o estímulo luminoso foi aplicado, além de aumentar o tempo de meia-vida desses fatores. As BMPs são importantes sinalizadores na formação óssea, o laser incrementa os níveis de fosforilação e BMP-2 que induzem a atividade da fosfatase alcalina (WU; XING, 2014). Todas essas cascatas foram observadas in vitro e embasam o conhecimento biomolecular sobre a bioestimulação óptica. Muitos marcadores e sinalizadores já foram utilizados a fim do conhecimento das reações moleculares em linhagens osteogênicas (HENG et al., 2004). O que se pode notar, é que os efeitos da fotobioestimulação no incremento e reparo do tecido ósseo vão muito além de uma simples interação, promovendo o desencadeamento de reações complexas e diversas em âmbito celular, culminando geralmente na aceleração dos processos testados, na dependência dos parâmetros utilizados, mas promovendo também a modulação do metabolismo das células ósseas.

O quadro 1 mostra um panorama da variabilidade de parâmetros de fotobioestimulação usados nos estudos in vitro e seus principais resultados.

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Quadro 1- Estudos laboratoriais (in vitro) da fotobioestimulação envolvendo células ósseas.

Autor (artigos ordenados por ano)

Tipo de célula óssea Meio ativo e comprimento de onda (λ) Potência (W ou mW) Forma de aplicação (pulso/contínuo) Densidade de energia J/cm² nº Energia total- (joules) por tratamento Principais resultados OZAWA et al., 1995 osteoblastos da calvária de ratos Laser diodo GaAlAs (830 nm) 60 mW Contínuo 346 - 3460 J/cm² (3 a 30min) grupo de irradiação múltipla (do 3º ao 21º dias/diariamente) X grupo de irradiação única 10,8 a 108 J / por ponto: 0,64J/cm²

Sugerem que a FBE Laser atue na estimulação inicial, mais do que nos períodos seguintes de diferenciação e

viabilidade celular (período inical estimulante). Houve maior atividade da FALC durante os estímulos iniciais

3º, 6º e 10º d. OZAWA et al., 1998 osteoblastos da calvária de ratos Laser GaAlAs

(830 nm) 500 mW Pulso Total: 3.82 J/cm² _(10min)

Hipótese da irradiação desempenhando a estimulação da formação óssea e viabilidade celular (inicialmente)

e posteriomente a estimulação da diferenciação celular), resultando em células osteoblásticas mais

diferenciadas e incremento da formação óssea. Observações que foram demonstradas apenas nos

osteoblastos imaturos e não nos maduros. DÖRTBUDAK; HAAS; MAIALATH- POKORNY, 2000 osteoblastos da medula óssea de ratos Laser (690nm) 21 mW pulso X contínuo 1,6 J/cm²- 60s (dias 3, 5 e 7)

Proposta de um novo método de fluorescência para comparação dos nódulos ósseos, os grupos experimentais (Laser pulsado) demonstraram maior

número de depósitos ósseos fluorescentes que os controles (Laser contínuo).

COOMBE et al., 2001 osteoblastos humanas (SaOS-2) Laser GaAlAs ( 830 nm) 90 mW contínuo 1,7-25,1 J/cm² (aplicação por 10 dias comparada a única)

0,3; 0,5; 1,2; 4J

A viabilidade celular não foi afetada pela irradiação. A LILT não foi capaz de estimular a viabilidade de

células e a FALC. Houve aumento de cálcio intracelular indicando alguma interação celular com a

irradiação. YAMAMOTO et al., 2001 osteoblastos da calvária de ratos MC3T3-E1 Laser GaAlAs (830 nm) 500 mW Contínuo 7,64 J/cm²

FBE incremetou a replicação do DNA, estimulou a viabilidade de osteoblastos e a expressão do gene MCM3 (envolvido no início da replicação do DNA).

HAMAJIMA et al., 2003 MC3T3-E1 Laser GaAlAs (830 nm) 500 mW (DP: 6.4 mW/cm2) Contínuo 7.64 J/cm² (20min)

O aumento da expressão do gene OGC promovido pela LILT ocorreu transitoriamente e apenas no primeiro estágio de proliferação celular. Os efeitos da LILT na expressão dos pequenos proteoglicanos ricos

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