Fotossíntese e anatomia foliar de plântulas de antúrio in vitro, cultivadas com diferentes concentrações de silício
RESUMO
Estudos sobre as modificações anatômicas decorrentes do cultivo in
vitro são fundamentais para o melhor entendimento no desenvolvimento das
plantas micropropagadas. Este trabalho foi realizado com o objetivo de avaliar diferenças morfológicas nas plantas, em consequência do uso do silício adicionado ao meio para o cultivo in vitro de Anthurium adreaenum cv. Rubi. Foram utilizados segmentos nodais de plântulas já estabelecidos in vitro e inoculados em meio Pierik adicionado de 30 g L-1 de sacarose e solidificado com 1,8 g L-1 de PhytagelTM. Foi adicionado ao meio silicato de sódio (Na2SiO3), nas
concentrações (0,0; 0,5; 1,0 e 2,0 mg L-1). O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado, com quinze repetições, sendo realizada a regressão dos dados. Os segmentos foram mantidos, por 100 dias, em sala de crescimento, sob
condições controladas. Foram avaliadas características anatômicas,
ultraestruturais e fotossintéticas. A densidade estomática, no meio contendo 1,0 mg L-1 de silicato de sódio foi o que apresentou maior densidade estomática. Para o diâmetro dos estômatos, maior diâmetro polar e equatorial da superfície abaxial ocorreu no tratamento com 2,0 mg L-1. Maior relação diâmetro polar e diâmetro equatorial foi observada para o ponto máximo, na concentração de 1,2
mg L-1. O acréscimo na concentração do silicato de sódio provocou diminuição
da espessura da epiderme abaxial, enquanto, para a epiderme adaxial, a espessura aumentou de forma quadrática, na concentração de 0,4 mg L-1. Na espessura da nervura central, observou-se um decréscimo acentuado até a concentração de 1,3 mg L-1. Para o mesofilo, a testemunha apresentou maior espessura, observando-se que a adição de silicato de sódio ao meio de cultura promove decréscimo em sua espessura. As plântulas cultivadas em silicato de sódio demonstraram diferenças significativas para a taxa fotossintética, a taxa transpiratória, a condutância estomática e a concentração interna de CO2. Já para
a razão entre concentrações interna e externa de CO2, não se observou diferença
estatística. A adição de silicato de sódio resultou no aumento da deposição de cera epicuticular e na formação de estruturas de depósito de reserva de cálcio em plântulas de antúrio. Em condições in vitro, a adição de silicato de sódio ao meio de cultura afetou o aparato fotossintético. Antúrio cv. Rubi apresenta
características anatômicas e fisiológicas que contribuem para a sobrevivência em ambiente ex vitro.
ABSTRACT
Studies on the anatomical changes resulting from in vitro culture are key to better understanding the development of micropropagated plants. This study was to evaluate morphological differences in plants as a result of the use of silicon added to the medium for the in vitro culture of Anthurium adreaenum cv. Rubi. Were nodal segments of seedlings established in vitro and inoculated in Pierik added 30 g L- 1 sucrose and solidified with 1.8 g L- 1 PhytagelTM. Were added to the medium, sodium silicate (Na2SiO3), at different concentrations (0.0,
0.5 , 1.0 and 2.0 mg L-1). The experimental design was completely randomized,
with fifteen repetitions being performed regression data. The segments were kept for 100 days in a growth chamber under controlled conditions. Were evaluated anatomical, ultrastructural and photosynthetic. The stomatal density,
the medium containing 1.0 mg L- 1 sodium silicate showed the highest stomatal
density. For the diameter of the stoma, the more polar and equatorial diameter of the abaxial surface was observed in treatment with 2.0 mg L- 1. Polar greater diameter ratio and diameter was observed to peak at a concentration of 1.2 mg L-
1
. The increase in the concentration of sodium silicate to the reduction of thickness of the lower epidermis, while that for the adaxial, the thickness increased quadratically in a concentration of 0.4 mg L- 1. The thickness of the central rib, there was a marked decrease until the concentration of 1.3 mg L- 1. For the mesophyll, the control showed a higher thickness, observing that the addition of sodium silicate to the culture medium promotes a decrease in its thickness. Seedlings grown in sodium silicate showed significant differences in photosynthetic rate, transpiration rate, stomatal conductance, internal CO2
concentration. As for the ratio between internal and external concentrations of CO2 there was no statistical difference. The addition of sodium silicate resulted
in increased epicuticular wax deposition and formation of structures reservation deposit of calcium anthurium seedlings. Under in vitro conditions, the addition of sodium silicate to the culture medium affect the photosynthetic apparatus.
Anthurium cv. Rubi has anatomical and physiological characteristics that
contribute to the survival ex vitro.
1 INTRODUÇÃO
No Brasil, a produção comercial de antúrios costumava ser oriunda de mudas obtidas por meio da propagação sexuada. As plantas propagadas dessa forma produzem flores com grande variabilidade de cores, formatos e tamanhos das espatas, dificultando a colheita de flores de mesmo padrão. O cultivo de cultivares nacionais resultantes da pesquisa desenvolvida pelo Instituto Agronômico de Campinas (IAC), aliado às técnicas de propagação in vitro, refletiu na melhoria da qualidade de produção, possibilitando a utilização da classificação das flores de acordo com os padrões desejados (DIAS et al., 2012). Assim, técnicas de cultura de tecidos vêm sendo empregadas para a rápida propagação clonal de novas variedades de antúrios. A produção de grande quantidade dessas plantas só é possível pela cultura in vitro, uma vez que, pelos métodos tradicionais de propagação, divisão de touceiras e estaquia, apenas algumas unidades de novas mudas podem ser obtidas anualmente (TOMBOLATO et al., 2004).
Diversas alterações na estrutura da folha de plantas mantidas in vitro têm sido reportadas, como aumento no tamanho e na densidade dos estômatos e a redução no controle estomático, na quantidade de cera epicuticular e na espessura do mesofilo, com alta proporção de espaços intercelulares (HAZARIKA, 2006; KHAN et al., 2003). Segundo Santana et al. (2008), a intensidade dessas alterações é bastante variável, em função de características próprias de cada espécie e sua quantificação poderá auxiliar na melhoria das condições de cultivo para cada grupo de plantas.
As desordens anatômicas são menos significativas em caule e raízes, porém, sua manifestação nas folhas afeta os dois principais processos realizados por estas, isto é, fotossíntese e trocas gasosas (DEBERG; MAENE, 1984).
A anatomia foliar pode contribuir para a compreensão da condição fisiológica e das modificações estruturais de plantas micropropagadas, fornecendo informação aplicável à planta na adaptação ao novo ambiente ex
vitro (MARIN, 2003).
A adição de silício adicionado ao meio de cultura pode beneficiar as plantas por aumento da hemicelulose e lignina, aumentando, assim, o grau de dureza da parede celular. Estas modificações aumentam a taxa de sobrevivência das plantas durante a aclimatização. Os efeitos diretos de silício são acompanhados por vários efeitos indiretos, incluindo aumento na capacidade fotossintética, redução de taxas transpiratórias, maior crescimento das plantas e aumento da resistência mecânica das células (VALENTE et al., 2004).
Em face do exposto, o presente trabalho foi realizado com o objetivo de mensurar os tecidos foliares de A. andreaenum cv. Rubi, visando identificar as alterações anatômicas, ultraestruturais e fotossintéticas em plântulas cultivadas
2 MATERIAL E MÉTODOS
O trabalho foi conduzido no Laboratório de Cultura de Tecidos, no Departamento de Agricultura da Universidade Federal de Lavras (UFLA), em Lavras, Minas Gerais.
Segmentos nodais de plântulas de antúrio estabelecidas in vitro foram
inoculados em meio Pierik (PIERIK, 1976) adicionado de 30 g L-1 de sacarose e
solidificado com 1,8 g L-1 de PhytagelTM. Silicato de sódio (Na2SiO3) foi
adicionado ao meio de cultura nas concentrações de 0,0; 0,5; 1,0 e 2,0 mg L-1, sendo 15 repetições (2 segmentos/frasco) por tratamento. O pH do meio de cultura foi ajustado para 5,8 e, em seguida, autoclavado, a 121°C e 1,2 atm, durante 20 minutos.
Posteriormente, em câmara de fluxo laminar, os segmentos nodais contendo uma gema foram inoculados em frascos de 400 mL, contendo 50 mL do meio de cultura Pierik com os respectivos tratamentos. Os frascos foram mantidos em sala de crescimento convencional, com fotoperíodo de 16 horas, temperatura de 25±2 °C e intensidade de 52,5W m-2 s-1.
Após 100 dias, foram avaliados os parâmetros descritos a seguir.
Características anatômicas – utilizou-se o terço médio da segunda
folha completamente expandida, coletada de 4 plantas diferentes por tratamento, previamente fixada em FAA 70% (formaldeído - ácido acético glacial - álcool
etílico 70%) (JOHANSEN, 1940), por 72 horas e, posteriormente, conservada
em etanol 70% (v/v-1). As secções transversais foram obtidas em micrótomo de
mesa tipo LPC e as secções paradérmicas à mão livre, com uso de lâmina de aço, que foram submetidas à clarificação com hipoclorito de sódio (1%-1,25% de cloro ativo), tríplice lavagem em água destilada, coloração com solução safrablau (azul de astra 0,1% e safranina 1%), para as secções transversais e
safranina 1%, para as secções paradérmicas, sendo, posteriormente, montadas em lâminas semipermanentes com água glicerinada (KRAUS; ARDUIN, 1997). As lâminas foram observadas e fotografadas em microscópio óptico modelo Olympus BX 60 acoplado à câmera digital Canon A630. As imagens foram analisadas em software para análise de imagens UTHSCSA Imagetool, com a medição de cinco campos por repetição, para cada variável analisada. Foram medidas a espessura da epiderme da face abaxial, a espessura da epiderme da face adaxial e a espessura do mesofilo. Para a caracterização dos
estômatos, analisaram-se densidade estomática (número de estômatos por mm2)
e diâmetros polar e equatorial, obtidos em microscópio Olympus CBB e Ken-a- vision 2100.
Características ultraestruturais – a análise foi realizada no
Laboratório de Microscopia Eletrônica, no Departamento de Fitopatologia da UFLA. Amostras do terço mediano de 4 folhas foram fixadas em Karnovsky (1965), pós-fixadas em tetróxido de ósmio (OsO4) e, em seguida, desidratadas
em soluções crescentes de acetona (30%, 50%, 70%, 90% e 100%), sendo, então, submetidas à secagem ao ponto crítico, utilizando-se CO2 como líquido
de transição (ROBARDS, 1978). Posteriormente, foram recobertas com ouro (20 nm) e analisadas, ao microscópio eletrônico de varredura LEO-EVO, seguindo o protocolo de Alves (2004).
Características fisiológicas - As taxas fotossintética e transpiratória das
plantas foram avaliadas com analisador de trocas gasosas por infravermelho (IRGA) modelo LI-6400. Para a avaliação dessas variáveis foram selecionadas folhas completamente expandidas em sete plantas por tratamento, a partir das 10h00min, tendo a densidade de fluxo de fótons fotossinteticamente ativos sido fixada na câmara do aparelho para 100 µmol m-2 s-1.
Delineamento experimental e análise estatística - o delineamento foi
campos para as secções transversais e paradérmicas. Os dados obtidos foram analisados por meio do programa estatístico SISVAR (FERREIRA, 2011), sendo realizada regressão nos dados.
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
De acordo com as observações anatômicas, as folhas de antúrio apresentam estômatos do tipo braquiparacíticos. Todas as células têm estômatos acompanhados, de cada lado, por duas células subsidiárias e célula-guarda com cloroplastos (Figura 1A e B). Os estômatos estão distribuídos na superfície da epiderme abaxial, classificando-os como folhas do tipo hipoestomáticas, estando de acordo com Mantovani, Filartiga e Coelho (2010) e Saito e Lima (2009).
Na caracterização da superfície foliar, maior deposição de cera epicuticular foi visualizada na epiderme adaxial das folhas de antúrio submetidas aos tratamentos com silicato de sódio, em relação à testemunha (Figura 1C, F, I, M).
Figura 1 Secções paradémicas evidenciando estômatos, da face abaxial de folhas de Anthurium andraeanum cv. Rubi cultivada in vitro, por 100 dias, em meio de cultura contendo concentrações de silicato de sódio. a) e b) Testemunha; d) e e) 0,5 mgL-1; g) e h) 1,0 mgL-1 e j) e l) 2,0 mgL-1, e da face adaxial c) Testemunha; f) 0,5 mgL-1; i) 1,0 mgL-1 e m) 2,0 mgL-1 (Lavras, 2013)
Quanto à densidade estomática por mm2, o meio contendo 1,0 mg L-1 de silicato de sódio (60 mm2) foi o que apresentou maior número de estômatos, comparado aos outros tratamentos. Posteriormente, ocorreu um decréscimo para a concentração de 2,0 mg L-1 (Gráfico 1). O aumento na densidade estomática nas folhas in vitro, comparado ao de folhas de plantas mantidas em ambiente natural, tem sido reportado em diversas espécies, estando associado,
principalmente, à elevada umidade relativa no interior dos recipientes de cultivo e à reduzida intensidade de luz (KHAN et al., 2003).
Gráfico 1 Características anatômicas em plântulas de Anthurium andraeanum cv. Rubi, aos 100 dias de cultivo, com diferentes concentrações de silicato de sódio (Lavras, 2013)
Segundo Hazarika (2006), a baixa intensidade de luz utilizada durante o cultivo in vitro, aliada ao acúmulo de etileno e à elevada concentração de sacarose no meio de cultura, é um dos principais responsáveis pela elevação na densidade de estômatos, acompanhada da reduzida capacidade de fechamento dos ostíolos.
Para o diâmetro dos estômatos, maior diâmetro polar e equatorial da superfície abaxial ocorreu no tratamento com 2,0 mg L-1 de silicato de sódio. No entanto, maior relação diâmetro polar e diâmetro equatorial foi observado para o ponto máximo na concentração de 1,2 mg L-1 de silicato de sódio (Gráfico 1).
Khan et al. (2002) afirmam que a relação diâmetro polar e equatorial (DP/DE) está associada ao formato das células-guarda e constitui uma importante particularidade sobre a funcionalidade dos estômatos, visto que a forma elíptica (maior DP/DE) é característica de estômatos funcionais, ao passo que a forma arredondada (menor DP/DE) está associada a estômatos que não apresentam funcionalidade normal. No entanto, cada espécie e condição de cultivo podem apresentar um resultado específico.
O mesofilo é homogêneo, não apresentando diferenciação entre os parênquimas paliçádico e esponjoso, o que foi observado em todos os tratamentos nesse trabalho (Figura 2), característica também relatada por Mantovani, Filartiga e Coelho (2010).
Figura 2 Fotomicrografias de secções transversais da lâmina foliar de Anthurium
andraeanum cv. Rubi aos 100 dias, com diferentes concentrações de
silicato de sódio. a) Testemunha; b) 0,5 mg L-1de silicato de sódio; c) 1,0 mg L-1; d) 2,0 mg L-1. e) Eletromicrografia da secção transversal da lâmina foliar com 0,5 mg L-1. Barra = 5mm (Lavras, 2013)
Para o mesofilo, a testemunha apresentou maior espessura, observando-se que a adição de silicato de sódio ao meio de cultura promove decréscimo em sua espessura (Gráfico 2), podendo ter ocorrido devido ao fato de silício promover a compartimentação em vacúolos, citoplasma ou na parede celular (LIANG et al., 2007). Alves, Giusti e Domingos (2001), trabalhando com um híbrido de
em função da redução dos espaços intercelulares, dificultando assim o deslocamento de gases nos tecidos. Esse comportamento não foi observado em nenhum dos trabalhos realizados com o silício in vitro (ASMAR et al., 2011; BRAGA et al., 2009; SOARES et al., 2012).
O acréscimo na concentração do silicato de sódio provocou diminuição da espessura da epiderme abaxial, enquanto para a epiderme adaxial a espessura aumentou de forma quadrática, na concentração de 0,4 mg L-1 de silicato de sódio, posteriormente registrando decréscimo em concentrações mais elevadas (Gráfico 2). Na espessura da nervura central, observou-se um decréscimo acentuado até a concentração de 1,3 mg L-1 de silicato de sódio, quando, então, teve início um acréscimo na espessura, na concentração de 2,0 mg L-1 (Gráfico 2).
Gráfico 2 Características anatômicas em plântulas de Anthurium andraeanum cv. Rubi, aos 100 dias de cultivo, com diferentes concentrações de silicato de sódio (Lavras, 2013)
a b
Observa-se, nos Gráficos 2B, C e D, que, com o acréscimo na concentração de silicato de sódio, houve diminuição em sua espessura. Essa diminuição pode ser devido à adição de silicato de sódio ao meio de cultura, concordando com Nwugo e Huerta (2008), que afirmam que o acúmulo de silício torna a folha mais ereta e rígida e com maior intercepção da luz, aumentando, assim, a eficiência fotossintética e o uso da água e da luz.
A nervura central nas Araceae tem forma variável, podendo ser simétrica, arredondada ou com formato deltoide, em ambas as superfícies, ou achatada ou largamente côncava adaxialmente, e convexa a arredondada abaxialmente (KEATING, 2003).
O Anthurium andreaenum cv. Rubi, em condições de cultivo in vitro, apresenta nervura mais proeminente na face abaxial, como observado na testemunha (Figura 3A). Com a adição de silicato de sódio ao meio de cultura, observou-se uma mudança visível em seu formato e espessura (Figura 3).
Figura 3 Fotomicrografias de secções transversais da lâmina foliar de Anthurium
andraeanum cv. Rubi, evidenciando a nervura central. a) Testemunha;
b) 0,5 mg L-1 de silicato de sódio; d) 1,0 mg L-1; e) 2,0 mg L-1. Barra = 5 mm (Lavras, 2013)
Em todos os tratamentos foram encontrados cristais de oxalato de cálcio, que são representados por drusas e ráfides (Figura 4), presentes no mesofilo e na epiderme da folha, característica citada por Mantovani, Filartiga e Coelho (2010) e por Mantovani e Pereira (2005). A ocorrência de diferentes tipos de cristais de oxalato de cálcio (drusas, ráfides, areia, prismáticos e, embora raros, estiloides) é citada para Araceae (KEATING, 2003). Keating (2002) demonstrou que dois tipos ou mais de cristais podem ocorrer simultaneamente no mesmo órgão em Araceae, como ráfides e drusas ocorrendo nas espécies de Anthurium.
Figura 4 Eletromicrografias e fotomicrografias, evidenciando cristais de oxalato de cálcio em Anthurium andraeanum cv. Rubi in vitro. a) e b) Cristais do tipo drusa, no tratamento com 2,0 mg L-1 de silicato de sódio, c) e d) cristais do tipo ráfide, no tratamento com 1,0 mg L-1 de silicato de sódio (Lavras, 2013).
Os cristais de oxalato de cálcio têm sido motivo de investigação pela sua importância ecológica, uma vez que a sua presença nas plantas é considerada como mecanismo de defesa contra a herbivoria (LUCAS et al., 2000; XIANG; CHEN, 2004), além da sua importância fisiológica, pois eles regulam o nível de cálcio nos tecidos (VOLK et al., 2002), além de auxiliar na distribuição da luz para os cloroplastos com a dissipação do excesso de luz durante períodos de alta intensidade luminosa (FRANCESCHI, 2001). Adicionalmente, há estudos que evidenciam que o excesso de cálcio pode ser estocado na forma de oxalato de
cálcio e que este cálcio pode ser remobilizado em certas condições (VOLK et al., 2002).
Neste trabalho, demonstrou-se que a baixa disponibilidade de Ca no meio de cultura Pierik induziu o armazenamento de Ca pelas plântulas in vitro em forma de cristais de oxalato de cálcio, como drusas e ráfides.
A fotossíntese corresponde à entrada básica de energia para as plantas e é essencial para o crescimento do vegetal, sendo ligada diretamente à estrutura das folhas (CASTRO; PEREIRA; PAIVA, 2009). A fotossíntese pode variar conforme o ambiente de cultivo da planta e as duas principais limitações ambientais para a taxa fotossintética são a disponibilidade de CO2 e a radiação
(ZHOU; HAN, 2005).
As plântulas cultivadas nas diferentes concentrações de silicato de sódio demonstraram diferenças significativas para a taxa fotossintética, taxa transpiratória, condutância estomática e concentração interna de CO2. Já para a
razão entre concentrações interna e externa de CO2, não se observou diferença
estatística (Tabela 1).
Tabela 1 Taxa fotossintética (A), carbono interno (Ci), transpiratória (E), condutância estomática (Gs) e relação carbono interno e externo (Ci/Ca), em folha de antúrio cultivada in vitro, por 100 dias, em meio de cultura contendo diferentes concentrações de silicato de sódio (Lavras, 2013) Silicato de sódio (mg L-1) A (µmol m-2s-1) Ci (µmol) E (µmol m-2s-1) Gs (µmol m-2s- 1) Ci/Ca Testemunha 1,37 a 263,59 b 0,35 b 0,02 b 1,29 a 0,5 0,86 b 266,01 a 0,41 a 0,03 a 1,29 a 1,0 1,47 a 99,06 d 0,10 c 0,01 b 1,04 a 2,0 0,84 b 202,09 c 0,24 c 0,01 b 1,56 a
Médias seguidas de mesma letra, nas colunas, não diferem entre si, pelo teste de Scott- Knott, a 5% de probabilidade
O carbono interno, a taxa de transpiração e a condutância estomática foram favoráveis na concentração de 0,5 mg L-1 de silicato de sódio, seguidos de uma redução em suas taxas com o incremento do silicato ao meio de cultura.
As taxas fotossintéticas foram maiores na testemunha e na concentração de 1,0 mg L-1 de silicato de sódio.
A fotossíntese pode variar conforme o ambiente de cultivo da planta e as duas principais limitações ambientais para a taxa fotossintética são a
disponibilidade de CO2 e a de radiação (ZHOU; HAN, 2005). Como a
quantidade de radiação foi fixada na câmara do IRGA (100 µmol m-2 seg-1), o aumento na taxa fotossintética observado para as plântulas cultivadas com silicato de sódio pode estar relacionado com adaptações morfológicas que favoreçam a captação de CO2 e o aproveitamento da radiação incidente nas
folhas. Dessa forma, a adição de 1,0 mg L-1 de silicato de sódio pode ter promovido um aumento na taxa fotossintética, por promover um aumento na densidade estomática (Gráfico 1) que favoreceu o fluxo de CO2 para o interior
da folha, permitindo maior aproveitamento da radiação incidente. Esses resultados demonstram que a adição de silicato de sódio é importante na melhoria na estrutura interna das folhas de antúrio cv. Rubi.
Com os resultados apresentados, pode-se inferir que a adição de silício ao meio de cultivo é benéfica para as características anatômicas, em que os fatores que regulam a perda de água na planta são favorecidos quando se acrescenta silicato ao meio.
Adicionalmente, as alterações que ocorrem na estrutura interna das folhas constituem aspectos determinantes na capacidade de aclimatização das espécies (HANBA; KOGAMI; TERASHIMA, 2002).
Para as outras concentrações, houve um aumento na presença de cera nas folhas in vitro de antúrio. Segundo Mohammadian, Watling e Hill (2007),