Fração hexânica

A fração hexânica (37,3 g) foi submetida a uma coluna cromatográfica de 60 cm de comprimento por 5 cm de diâmetro, contendo 250 g de sílica-gel 60 de granulometria 70-230 mesh e empacotada com hexano. A eluição foi feita com gradiente crescente de polaridade: hexano, hexano/acetato de etila, acetato de etila e metanol, controlando-se a vazão em 30 gotas/min. Foram coletadas 120 frações, as quais foram monitoradas por cromatografia em camada delgada. As frações que

Folhas secas 1.360 Kg

Fração Hexânica

45,2 g =16,80% Fração Diclorometano 33,8 g = 12,56% Extrato Metanólico Bruto

MeOH/H2O – 90:10mL

269 g

Maceração MeOH 7 dias

Fração Acetato de Etila 7,8 g = 2,90% Hex-1/9 (hidrocarbonetos) Eupomatenóide-3 (Hex-14/33= 926 mg) Eupomatenóide-5 (Hex-51/81=2546 mg) Conocarpano (DCM -22 = 918 mg) Conocarpano (DCM-22)

518,8 mg 7-MeO-apigenina (AE-19/21=12 mg) _{Orientina (AE-31/75 = 972 mg)}

Hesperidina (AE-49/65= 43 mg) Luteína-7- rutinosídeo (AE-72/101=

apresentaram perfil cromatográfico semelhantes, foram reunidas conforme tabela 11 demonstrada abaixo:

TABELA 11 – Sistema de eluição utilizado na separação dos compostos da fração hexânica

FRAÇÕES ELUENTE FRAÇÃO EM ESTUDO

1 – 9 Hexano Hex – 1/9

10 – 13 Hexano -

14 – 33 Hexano e Hexano (9)/ AE (1) Hex - 14/33

34 – 50 Hexano (9)/AE(1) -

51 – 81 Hexano (9)/AE(1) e Hexano (8)/ AE (2) Hex – 51/81

82 – 100 Hexano (7)/AE (3) e Hexano (5)/AE (5) -

101-120 Acetato de etila e etanol -

4.2.4.1.1 Tratamento da subfração Hex-1/9

A subfração Hex – 1/9 (930 mg) eluída com hexano, apresentou à formação de 265,7 mg de um precipitado semi-sólido amorfo e leitoso, o qual foi analisado por cromatografia em camada delgada e cromatografia gasosa. A cromatografia gasosa foi realizada nas seguintes condições: coluna capilar de sílica fundida de 30 m de comprimento e Hidrogênio (H2) como gás de arraste, programação linear com temperatura de 40oC a 305oC, velocidade de programação de 8oC/min, temperatura do injetor de 280oC, temperatura do detector de 310oC, com splitless e isoterma de 10 min. 5,0 mg da amostra foram diluídos para 1 mL de diclorometano, sendo injetado no cromatógrafo gasoso um volume de 1,0 µL. O cromatograma nos revelou que a subfração Hex-1/9 trata-se de uma mistura. Visando a elucidação da mistura Hex-1/9, a presente subfração foi submetida a análise por cromatografia gasosa acoplada a um espectrometrometro de massas.

4.2.4.1.2 Tratamento da subfração Hex-14/33

A subfração Hex-14/33 (2.388 g) formou cristais incolores e alongados após a evaporação espontânea do solvente em meio a uma impureza com aspecto oleoso e de coloração amarela. Visando a sua purificação esta subfração foi submetida novamente

a uma coluna cromatográfica (CC) e eluída com gradiente crescente de polaridade: hexano, hexano/ acetato de etila, acetato de etila e etanol. Foram coletadas 45 subfrações, sendo que nos frascos 5 a 24, eluída com hexano e hexano/acetato de etila 9:1 precipitou 713,6 mg de cristais incolores e alongados, insolúveis em hexano e solúveis em diclorometano, os quais foram denominados de Hex-14/33. Estes cristais foram analisados por CCD e eluídos na fase móvel: hexano e acetato de etila 9:1. As cromatoplacas foram submetidas à luz UV e observou-se fluorescência azul em 360 nm e roxa em 254 nm, que após revelação com anisaldeído sulfúrico e aquecimento, desenvolveu uma única mancha de coloração azul-acinzentada com Rf 0,39. Posteriormente, estes cristais foram submetidos a uma cromatografia gasosa, utilizando-se uma coluna capilar de sílica fundida de 30m de comprimento e hidrogênio (H2) como gás de arraste, nas condições: programação linear com temperatura de 40oC a 305oC, velocidade de programação de 8oC/min, temperatura do injetor de 280oC, temperatura do detector de 310oC, com splitless e sem isoterma. 5,0 mg da amostra foram diluídos para 1 mL de diclorometano, sendo injetado no cromatógrafo gasoso um volume de 1,0 µL.

Determinou-se o ponto de fusão do composto Hex-14/33, sendo que a temperatura inicial de fusão foi de 105oC e o término do processo ocorreu na temperatura de 107oC. Posteriormente, estes cristais foram submetidos às análises espectroscópicas de RMN 1H, RMN 13C/ DEPT para a elucidação de sua estrutura química e enviados para testes biológicos.

4.2.4.1.3 Tratamento da subfração Hex-51/81

A subfração Hex-51/81 (16,50 g) foi submetida a uma cromatografia em coluna e eluída com mistura de solventes de gradiente crescente de polaridade: hexano; hexano: acetato de etila; acetato de etila e etanol. Foram coletadas 76 subfrações. Durante a eluição com hexano e acetato de etila 9:1 nas subfrações 34 a 40 ocorreu à formação de 321mg de cristais incolores e alongados os quais foram denominados de Hex-51/81. O perfil fitoquímico destas subfrações foi determinado por cromatografia

em camada delgada utilizando-se a fase móvel hexano e acetato de etila 7:3. Verificamos que as cromatoplacas apresentavam fluorescência arroxeada no UV-curto e ausência de fluorescência no UV-longo. Após a revelação com anisaldeído sulfúrico e aquecimento, ocorreu o desenvolvimento de uma única mancha de coloração azul- acinzentada com Rf 0,45. Esses cristais foram submetidos a uma cromatografia gasosa, utilizando-se uma coluna capilar de sílica fundida de 30 m de comprimento e H2 como gás de arraste, nas condições: programação linear com temperatura de 40oC a 305oC, velocidade de programação de 8oC/min, temperatura do injetor de 280oC, temperatura do detector de 310oC, com splitless e sem isoterma. 5,0 mg da amostra foram diluídos para 1 mL de diclorometano, sendo injetado no cromatógrafo gasoso um volume de 1,0 µL. Posteriormente, foi submetido a análises espectroscópicas de IV, RMN1H e 13_{C/DEPT para a sua devida identificação química.}

Nas subfrações 50 a 66 eluídas com hexano e acetato de etila 9:1 precipitaram 4,03 g de cristais incolores e alongados os quais foram analisados por CCD e observou-se após revelação apresentar uma única mancha azulada. Estes cristais foram analisados por cromatografia gasosa, nas condições acima citadas e verificou-se que é constituída por uma misturas de 3 compostos, os quais apresentam o mesmo Rf na CCD.

Visando a purificação da mistura de compostos das subfrações 50-66 acima mencionada, esta foi recromatografada em coluna cromatográfica de 60 cm de comprimento por 4 cm de diâmetro e empacotada com 120 g de sílica-gel 60 de granulometria 70-230 mesh e hexano. Como os compostos desta mistura têm o mesmo Rf em CCD, a coluna foi eluída com hexano 100 %, hexano 99 %: acetato de etila 1 % e hexano 98 %: acetato de etila 2 %, sendo que todo o processo de purificação foi acompanhado por cromatografia em camada delgada e as revelações foram comparadas com padrões dos compostos, Hex-14/33, Hex-51/81 e DCM-22 isolados em colunas anteriores. Nas subfrações 5 a 20 eluída com hexano, após a evaporação do solvente ocoreu a formação de 219 mg de cristais aciculares incolores, os quais foram analisados por CCD e comparado o Rf com os padrões acima mencionados. Nas subfrações 25 a 71 ocorreu a formação de 2270 mg destes cristais, os quais foram

denominados de Hex – 51/81. Ao serem analisados por CCD sob luz UV, observou-se que apresentam fluorescência roxa no comprimento de onda de 250 nm e não emitem fluorescência no comprimento de onda de 360 nm. Após nebulização com anisaldeído sulfúrico e aquecimento, ocorreu o desenvolvimento de uma única mancha de coloração azul-acinzantada com Rf 0,45. A revelação das subfrações 25-71 é semelhante a do padrão Hex-51/81, o qual sob luz UV emitem fluorescência roxa no comprimento de onda de 250 nm e fluorescência azul no comprimento de onda de 360 nm. Após nebulização com anisaldeído sulfúrico e aquecimento este composto revela uma mancha de coloração acastanhada. A partir da subfração 72 até a subfração 99 foram eluídas com a fase móvel hexano 99 % e acetato de etila 1 %, os cristais obtidos foram analisadas por CCD e os perfis cromatográficos foram semelhantes ao do padrão DCM-22. As subfrações 100 – 117 foram eluídas com hexano 98 % e acetato de etila 2 % e analisadas por CCD, sendo os perfis cromatográficos também semelhantes ao do padrão DCM-22. O esquema de fracionamento esta demonstrado nas tabelas 12 e 13, abaixo:

TABELA 12 – Sistema de eluição utilizado na separação dos compostos da subfração Hex-51/81

SUBFRAÇÕES ELUIÇÃO RF 254 - 360 LUZ UV

nm

ANISALDEÍDO

SULFÚRICO COMPOSTO

1-33 Hexano, hexano (99):AE

(1) - - - - -

34 – 40 Hexano(98):AE(2) 0,45 Roxa - azul-acinzentada Hex-51/81

41- 49 Hexano(98):AE(2) - - - - -

50-66 Hexano(97):AE(3) 0,45 Roxa Azul Azulão Mistura

TABELA 13 – Sistema de eluição utilizado na purificação da subfração Hex-51/81- 50/66

SUBFRAÇÕES ELUIÇÃO RF _{254 – 360 nm} FLUORESC. ANISALDEÍDO _SULFÚRICO COMPOSTO

1 – 4 Hexano 100% - - - - -

5 – 20 Hexano 100% 0.45 Roxa Azul Azul acinzentada Hex – 14/33

21 – 24 Hexano 100% - - - - -

25 – 71 Hexano 100% 0,45 Roxa - Azul acinzentada Hex-51/81

72 – 99 _{Hexano 99%: AE1% 0,45 Roxa Azul Tijolo} Hex-51/81-

72/99

100 – 117 Hexano 98%: AE2% 0,45 Roxa Azul Tijolo DCM-22

Amostras destes 3 compostos foram enviadas para análise espectroscópica de RMN 1H e RMN 13C e assim, as suas respectivas identificações químicas.