As massas do extrato bruto e das frações obtidas após o fracionamento são apresentadas na Tabela 1.
Tabela 1 - Massas do extrato bruto e das frações obtidos a partir do extrato bruto
Frações H. apiculata Z. fagara
Extrato bruto 1400g 720g
Etérea ácida 175g 96g
Etérea básica 12,9g 8,6g
Acetato básica 33,0g 18,0g
As frações obtidas, de ambas as plantas, foram submetidas à análise em CCD, utilizando-se vários sistemas de solvente, e reveladas em lâmpada UV254nm e UV365nm, reagente de Dragendorff e ácido sulfúrico/álcool etílico (5:95 v/v). Deste modo observou-se que as frações, etérea e acetato, básicas apresentaram manchas alaranjadas frente ao reagente Dragendorff, mostrando positividade para alcaloides. Já a fração etérea ácida e a fração butanólica básica, apresentaram manchas escuras quando reveladas em ácido sulfúrico, seguido de aquecimento.
As frações etérea, ácida e básica, e acetato básica foram analisadas individualmente através de separações em colunas cromatográficas (CC), cromatografia em camada delgada preparativa (CCDP) e recristalizações como meios de purificação dos compostos identificados neste trabalho.
4.2.2 Frações de Helietta apiculata Benth
4.2.2.1 Fração etérea ácida (FEA)
Uma porção da fração etérea ácida (40,0 g) foi submetida à separação em coluna cromatográfica (CC), utilizando sílica gel (70-230 mesh) como fase estacionária. Essa massa da FEA foi dividida em duas CC (20,0 g de amostra/600,0 g de sílica) que foram eluídas com hexano, diclorometano e acetona em sistema de gradiente. Foram coletadas 181 frações de 100 mL em cada CC e rotaevaporadas. Após comparação em CCD, as frações das duas CC foram reunidas conforme suas similaridades, como apresentado na Tabela 2.
Tabela 2 - Separação em CC da Fração Etérea Ácida de H. apiculata
Subfrações % Solventes Substâncias Massa
I - 1 a 10 Hexano Mistura 0,9 g
II - 11 a 27 Hexano/Dicloro 25% 126 + mistura 1,8 g
III - 28 a 71 Hexano/Dicloro 50% 116 + 122 + T39 + mistura 7,2 g
IV - 72 a 102 Dicloro 52 + 80 + mistura 3,1 g
V - 103 a 138 Dicloro 51 + 53 + 115 + mistura 6,5 g
VI - 139 a 157 Dicloro/Acetona 25% Mistura 2,9 g
VII - 158 a 171 Dicloro/Acetona 50% Mistura 1,4 g
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A subfração II (1,8 g) foi submetida a uma nova CC (150 g de sílica) com gradiente de hexano/diclorometano. Na fração hexano/dicloro 50% houve a formação de um precipitado, que foi submetido à purificação através de lavagem com hexano/acetona 2%, originando 90 mg de um precipitado branco, identificado com ácido tetracosanóico (126).
A subfração III (7,2 g) também foi submetida a uma nova CC (400 g de sílica) com gradiente de hexano/diclorometano/acetona. A fração hexano/dicloro 25% forneceu uma mistura de dois compostos majoritários, que foram submetidos à Cromatografia em Camada Delgada Preparativa (CCDP) para purificação. Essa CCDP foi eluida com hexano/dicloro 50%, fornecendo 12 mg do composto O-prenilcinamato de metila (122) e 8,0 mg do composto chamado tanizina (116). Na fração hexano/dicloro 50% houve a formação de um precipitado branco (2,6 g), identificado como uma mistura de terpenos (T39).
Uma nova CC foi realizada a partir da subfração IV (3,1 g de amostra, 200 g de sílica) da FEA, sendo eluida com gradiente de hexano/dicloro/acetona. A fração hexano/dicloro 50%, forneceu um composto majoritário, que foi submetido à CCDP (hexano/dicloro 50%), originando 32 mg de um sólido branco, identificado como rutacultina (52). A fração dicloro forneceu um sólido cristalino branco (150 mg), identificado como β-sitosterol (80).
A fração V (6,5 g) também foi recromatografada (350 g de sílica) com sistema eluente hexano/acetona em gradiente de polaridade. Após submeter à fração hexano/acetona 10% à uma CCDP (dicloro 100%) houve o isolamento de 40,0 mg do composto identificado como graveliferona (115). A fração hexano/acetona 20%, também após CCDP com eluição de dicloro, forneceu 15,0 mg do composto ulismoncadina (53), enquanto na fração hexano/acetona 30% houve a formação de um precipitado, que após recristalização com acetona forneceu 210,0 mg do composto chalepina (51).
4.2.2.2 Fração Etérea Básica (FEB)
Uma porção de 8,0 g da fração etérea básica foi submetida a um fracionamento em CC, utilizando hexano/diclorometano/acetato de etila/metanol como sistema eluente, e 250,0 g de sílica (70-230 mesh) como fase estacionária. Foram coletadas 138 frações de 100 mL e rotaevaporadas. Estas foram reunidas conforme suas similaridades, quando comparadas em CCD, conforme descrito na Tabela 3.
Tabela 3 - Separação em CC da Fração Etérea Básica de H. apiculata
Subfrações % Solventes Substâncias Massa
I - 1 a 9 Hexano Mistura 0,112 g
II - 10 a 30 Hexano/Dicloro 25% Mistura 0,25 g
III - 31 a 53 Hexano/Dicloro 50% 8 + 9 + 11 + mistura 1,1 g
IV - 54 a 80 Dicloro 10 + 12 + 13 + 15 + 22 + mistura 1,8 g
V - 81 a 97 Dicloro/Acetato 25% 92 + mistura 1,5 g
VI - 98 a 114 Dicloro/Acetato 50% 58 + mistura 0,62 g
VII - 115 a 124 Acetato Mistura 0,36 g
VIII - 125 a 138 Acetato/Metanol 50% Mistura 0,19 g
Na subfração V, houve a formação de um sólido cristalino, que foi submetido à recristalização com acetona, fornecendo 600,0 mg do composto identificado como o limonoide limonina (92).
A subfração III (1,1 g) foi submetida a uma nova CC (55,0 g de sílica) com hexano/dicloro/acetato de etila como sistema eluente. As frações, hexano/dicloro 50% e dicloro 100%, quando reveladas em CCD com reagente de Dragendorff indicaram a presença de alcaloides. O composto presente na fração hexano/dicloro 50% foi purificado em CCDP (hexano/dicloro 50%), levando ao isolamento de 18,0 mg do alcaloide dictamina (8). A fração dicloro 100% também foi submetida à CCDP (dicloro 100%), proporcionando o isolamento de outros dois alcaloides, γ-fagarina (9) e maculina (11), com 6,0 e 65,0 mg respectivamente.
A subfração IV (1,8 g), que em CCD revelou a presença de alcaloides, foi recromatografada (150,0 g de sílica) com sistema eluente hexano/dicloro/acetona em gradiente crescente de polaridade. A fração dicloro, depois de submetida à CCDP (dicloro) forneceu 50,0 mg do alcaloide flindersiamina (15). A fração dicloro/acetona 2%, forneceu 42,0 mg do alcaloide quinolinona (22) após realização da CCDP (dicloro 100%). Na fração dicloro/acetona 10%, também houve a identificação de alcaloides, que foram isolados a partir de CCDP (dicloro/acetona 2%), levando à obtenção dos alcaloides kokusaginina (13) (30,0 mg), maculosidina (12) (6,0 mg) e esquimianina (10) (4,0 mg).
Uma nova CC, realizada com a subfração VI (620,0 mg de amostra, 60,0 g de sílica), com eluição de dicloro/acetona, forneceu um composto majoritário da fração dicloro/acetona 20%. Após purificação deste, em CCDP (dicloro/acetona 10%), obteve-se 10,0 mg do composto cristalino escopoletina (58).
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4.2.2.3 Fração Acetato Básica (FAB)
Uma porção da fração acetato básica (25,0 g) foi cromatografada em coluna, utilizando-se sílica (500,0 g) como fase estacionária, e hexano/acetato de etila/metanol como sistema eluente. Foram coletadas 182 frações de 100 mL e rotaevaporadas, sendo reunidas conforme suas similaridades após comparação de CCD, conforme descrito na Tabela 4.
Tabela 4 - Separação em CC da Fração Acetato Básica de H. apiculata
Subfrações % Solventes Substâncias Peso
I - 1 a 22 Hexano Mistura 0,98 g
II - 23 a 57 Hexano/Acetato 10% Mistura 1,5 g
III - 58 a 71 Hexano/Acetato 25% 120 + 121 + mistura 4,2 g
IV - 72 a 96 Hexano/Acetato 50% 98 + 123 + mistura 1,9 g V - 97 a 115 Acetato Mistura 1,8 g VI - 116 a 139 Acetato/Metanol 25% 24 + mistura 2,6 g VII - 140 a 168 VIII – 169 a 182 Acetato/Metanol 50% Metanol Mistura Mistura 3,7 g 3,4 g
A subfração III (4,2 g) foi submetida a uma nova CC (350 g de sílica) com gradiente de hexano/acetona. Da fração hexano/acetona 20% foi obtido um sólido cristalino, após evaporação do solvente, este foi identificado como 4-hidroxi-3,5-dimetoxicinamato de metila (120) com 150,0 mg. Na fração hexano/acetona 30% também ocorreu a formação de um sólido, identificado como 4-hidroxi-3,5-dimetoxicinamato de etila (121) (95,0 mg).
Uma nova CC (155 g de sílica) foi realizada com a subfração IV (1,9 g) da FAB, com eluição de dicloro/acetato de etila em gradiente crescente de polaridade. A fração dicloro/acetato 20% foi submetida à CCDP (dicloro/acetona 10%), levando ao isolamento de
4,0 mg do composto 2-(4-hidroxi-3-metoxifenil)-3-(hidroximetil)-7-metoxi-2,3-di-
idrobenzofuran-5-il)acrilato de etila (123). Na fração dicloro/acetato 25% ocorreu a identificação de um composto majoritário em analise de CCD, sendo obtido 20,0 mg do composto xilobuxina (98) após purificação da fração em CCDP (dicloro/acetona10%).
Outra fração que foi recromatografada foi a fração VI (2,6 g), com eluição de dicloro/acetato/metanol, utilizando 210,0 g de sílica. A fração dicloro/acetato 25%, indicou a presença de alcaloide em CCD quando revelada com Dragendorff. Esta fração foi submetida à
CCDP (dicloro/acetato 20%), levando ao isolamento de 40,0 mg do alcaloide isodictamina (24).
4.2.3 Frações de Zanthoxylum fagara (L) Sarg.
4.2.3.1 Fração Etérea Ácida (FEA)
Uma porção da fração etérea ácida (30,0 g) foi submetida a separação cromatográfica. Essa massa da FEA foi dividida em duas CC (15,0 g de amostra/ 500,0 g de sílica), e hexano/acetona foi utilizado como sistema eluente. Foram coletadas 181 frações de 100 mL e rotaevaporadas, após comparação em CCD, as frações foram reunidas conforme suas similaridades, como apresentado na Tabela 5.
Tabela 5 - Separação em CC da Fração Etérea Ácida de Z. fagara
Subfrações % Solventes Substâncias Massa
I - 1 a 12 Hexano Mistura 1,8 g
II - 13 a 34 Hexano/acetona 5% 34 + mistura 2,4 g
III - 35 a 51 Hexano/acetona 10% 80 + 119 + mistura 4,2 g
IV - 52 a 85 Hexano/acetona 15% Mistura 2,1 g
V - 86 a 103 Hexano/acetona 20% Mistura 1,8 g
VI - 104 a 129 Hexano/acetona 25% Mistura 1,5 g
VII - 130 a 153 Hexano/acetona 30% Mistura 3,2 g
VIII - 154 a 168 Hexano/acetona 50% Mistura 2,7 g
IX - 169 a 181 Acetona Mistura 2,2 g
Uma porção da subfração II (2,4 g) foi submetida a uma nova CC (200,0 g de sílica), com eluição de hexano/acetona. Na fração hexano/acetona 5% houve a formação de um precipitado, que após a eliminação de impurezas, através da lavagem com hexano/acetona 3%, forneceu 3,2 mg do alcaloide identificado como diidrocheleritrina (34).
A subfração III (4,2 g) também foi submetida a uma nova separação em CC, utilizando-se 340,0 g de sílica e hexano/acetona como sistema eluente. Na fração hexano/acetona 5%, houve a formação de precipitado, que após lavagem com acetona forneceu 42,0 mg do composto identificado como Z-alatamida (119). Ainda dessa CC, na
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fração hexano/acetona 10%, houve a formação de um sólido cristalino, que após lavagem com hexano, foi identificado como o β-sitosterol (80).
4.2.3.2 Fração Etérea Básica (FEB)
A fração etérea básica (8,0 g) foi submetida à separação em coluna cromatográfica (400,0 g de sílica), eluida com hexano/dicloro/acetona em gradiente crescente de polaridade. Foram coletadas 136 frações de 100 mL, rotaevaporadas e reunidas conforme suas similaridades, quando comparadas em CCD, conforme descrito na Tabela 6.
Tabela 6 - Separação em CC da Fração Etérea Básica de Z. fagara
Subfrações % Solventes Substâncias Massa
I - 1 a 12 Hexano Mistura 150 mg
II - 13 a 28 Hexano/Dicloro 25% Mistura 260 mg
III - 29 a 46 Hexano/Dicloro 50% 118 + mistura 1,2 g
IV - 47 a 75 Dicloro Mistura 1,3 g
V - 76 a 97 Dicloro/Acetona 25% 69 + 70 + 117 + mistura 1,8 g
VI - 98 a 114 Dicloro/Acetona 50% Mistura 620 mg
VII - 115 a 136 Acetona Mistura 360 mg
Na subfração V, houve a formação de um sólido cristalino, que foi submetido à lavagem com acetona para purificação, fornecendo 500,0 mg do composto identificado como tembamida (69).
A subfração III (1,2 g) foi submetida a uma nova CC (g) com gradiente de hexano/dicloro. Na fração 100% dicloro houve a formação de um sólido cristalino (18,0 mg), identificado como E-alatamida (118).
A subfração V (1,0 g) foi recromatografada em CC (g), utilizando hexano/acetona em gradiente, levando ao isolamento de outros dois metabólitos. Da fração hexano/acetona 15% foi obtido um sólido cristalino (115,0 mg), identificado como O-metiltembamida (70), enquanto da fração hexano/acetona 50%, foi identificado um composto majoritário. Esta fração foi submetida a uma CCDP (hexano/acetona 30%), levando ao isolamento de 18,0 mg do composto balsamida (117).
4.2.3.3 Fração Acetato Básica (FAB)
Uma porção da fração acetato básica (14,0 g) foi submetida à separação em coluna cromatográfica (CC), utilizando sílica gel (500,0) como fase estacionária, eluída com hexano/acetona/metanol em gradiente de polaridade. Foram coletadas 171 frações de 100 mL e rotaevaporadas. Após comparação em CCD, e reunidas conforme suas similaridades. As frações obtidas são apresentadas na Tabela 7.
Tabela 7 - Separação em CC da Fração Acetato Básica de Z. fagara
Subfrações % Solventes Substâncias Massa
I - 1 a 15 Hexano/acetona 5% Mistura 0,42 g
II - 16 a 37 Hexano/Acetona 10% 33 + mistura 0,96 g
III - 38 a 61 Hexano/Acetona 25% Mistura 1,4 g
IV - 62 a 86 Hexano/Acetona 50% 124 + mistura 2,3 g V - 87 a 105 Acetona Mistura 0,95 g VI - 106 a 129 Acetona/Metanol 25% Mistura 1,8 g VII - 130 a 158 VIII – 159 a 171 Acetona/Metanol 50% Metanol Mistura Mistura 1,2 g 1,1 g
A subfração II (960,0 mg) foi submetida a uma nova CC (80,0 g de sílica), com eluição de dicloro/acetona. Na fração dicloro/acetona 3%, quando analisada em CCD, demonstrou a presença de um composto majoritário, que revelou ser um alcaloide, assim a fração foi submetida à CCDP (dicloro/acetona 2%) levando ao isolamento do alcaloide 6-acetonildiidrocheleritrina (33) (6,4 mg).
Uma nova coluna cromatográfica foi realizada com a subfração IV (2,3 g de amostra/200 g de sílica), com gradiente de polaridade de dicloro/acetona. Da fração dicloro/acetona 20% foi isolado, através de CCDP (dicloro/acetona 20%) o composto identificado como tripterigiol (124).
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4.3 MODIFICAÇÕES ESTRUTURAIS
4.3.1 N-metilação do alcaloide flindersiamina (15)
6 7 8 8a 4a 5 N+ 9a 3a 4 O 2 3 OCH11 3 O 10 O 15a OCH3 12 13 6 7 8 8a 4a 5 N 9a 3a 4 O 2 3 OCH11 3 O 10 O OCH3 12 15 CH3I