Fundamentos teóricos

A separação cromatográfica é dependente da diferença de velocidade a que cada um dos componentes é eluido. Estas velocidades são determinadas pelo coeficiente de partição dos solutos entre as duas fases [9].

Considerando a espécie X, o equilíbrio é descrito pela seguinte equação [9]:

A constante de equilíbrio K para esta reacção é o chamado coeficiente de partição que caracteriza o equilíbrio que se estabeleceria na distribuição da substância entre as fases móvel e estacionária se o fluxo fosse estacionário e é definido como:

em que CS é a concentração molar analítica do soluto na fase estacionária e CM é a

concentração analítica na fase móvel [10]. Idealmente, o coeficiente de partição deverá ser constante ao longo de uma elevada gama de concentrações, isto é, CS é directamente

proporcional a CM [9]. ia estacionár fase móvel fase

X

X

O tempo de retenção, tR, é o período de tempo que decorre entre a injecção da

amostra e o aparecimento de pico cromatográfico do soluto detectado pelo detector à saída da coluna cromatográfica e é determinado pela expressão :

em que L é o comprimento da coluna e v a velocidade média linear de migração do soluto [9].

A figura 4.3 representa um cromatograma exemplificativo do processo de eluição ao longo de uma coluna cromatográfica. O pico de área inferior representa o soluto não retido na coluna (já que não sofre qualquer tipo de interacção com a fase estacionária), migrando ao longo da coluna à mesma velocidade que o eluente. Assim, o seu tempo de retenção, tm, é aproximadamente igual ao tempo necessário à passagem de uma molécula da fase móvel através da coluna. Para além do tempo absoluto, necessário ao percurso livre, as moléculas são retardadas no seu caminho pelas interacções com a fase estacionária, as quais exigem um tempo adicional. Assim, o tempo decorrido entre a entrada do analito na coluna e a sua saída (tr) é o resultante da soma deste último com tm [10].

Fig. 4.3 - Cromatograma representativo do processo de eluição.

A razão entre tr e tm é uma grandeza representativa da interacção com a fase líquida, permitindo descrever as velocidades de migração dos solutos em colunas cromatográficas. Esta grandeza é designada por coeficiente de capacidade [10]. Para um dado soluto A, o coeficiente de capacidade kA é definido por [9]:

v L t_r = tr tm Sinal Tempo

Instrumentação

De acordo com a figura 4.3 constata-se que os valores de tr e tm podem ser

facilmente obtidos a partir do cromatograma. Quando o factor de capacidade relativo a determinado soluto é inferior à unidade, a eluição ocorre muito rapidamente invalidando a separação dos componentes da mistura e consequentemente a possibilidade de os identificar e quantificar. Quando o factor de capacidade assume valores superiores a 20 ou 30, o tempo de eluição torna-se excessivamente longo. Idealmente, as separações deverão ser efectuadas a coeficientes de capacidade com valores compreendidos entre 1 e 5 [9].

Na cromatografia gasosa é possível variar o coeficiente de capacidade por controle de temperatura [9] por forma a obter as condições óptimas de operação.

A posição relativa de dois picos consecutivos no cromatograma é definida pelo valor da retenção relativa ou coeficiente de selectividade [10] que relativamente à separação de duas espécies A e B é definido por:

em que KB é o coeficiente de partição relativo à espécie mais retida, B, e KA é a constante

relativa à espécie eluida mais rapidamente, A [9]. De acordo com esta definição, α é sempre superior à unidade [9].

O valor de α é a razão entre os tempos de retenção ajustados dos picos relativos a cada uma das espécies a separar e traduz as diferenças de interacção com a fase estacionária correspondentes a cada uma delas (ou seja, a razão entre os respectivos valores de K). No entanto, a separação dos picos cromatográficos depende, em última análise, da

eficiência da coluna [10].

A eficiência cromatográfica é afectada pelo alargamento das bandas cromatográficas que ocorre aquando da passagem do composto através da coluna [9].

Efectivamente, a concentração de moléculas de soluto no efluente que emerge da coluna em função do tempo corresponde idealmente a uma curva do tipo gaussiano. A largura deste pico é a consequência final das influências de factores extra e intra-coluna que contribuem para o alargamento da banda. Entre os factores extra e intra-coluna que

A B K K = α m m r A

t

t

t

k

=

−

contribuem para uma maior dispersão da distribuição da população molecular em função do tempo, desempenham papel preponderante a largura da banda inicial e a existência de volumes mortos [10]. Além disso, como o alargamento das bandas cromatográficas com a consequente diminuição da eficiência da coluna cromatográfica resulta da velocidade finita a que ocorrem os processos de transferência de massa entre a fase estacionária e a fase móvel durante a migração do soluto através da coluna torna-se necessário controlar algumas das variáveis que afectam esta velocidade, nomeadamente, a velocidade linear da fase móvel, o coeficiente de difusão das fases móvel e estacionária (aumentando com o incremento de temperatura e com a diminuição da viscosidade), o coeficiente de capacidade e a espessura do filme da fase estacionária [9].

Existem dois parâmetros geralmente usados como medida da eficiência das colunas cromatográficas: a altura do prato teórico. h, e o número de pratos teóricos, N, relacionados pela expressão:

em que L é o comprimento da coluna cromatográfica [9].

A eficiência duma coluna cromatográfica sofre um incremento à medida que aumenta o número de pratos teóricos e diminui a altura do prato.

O número de pratos teóricos pode ser determinado experimentalmente pela expressão:

em que W é a largura do pico na base do cromatograma expressa em unidades de tempo [9].

A resolução de uma coluna R constitui uma medida quantitativa da sua capacidade

em separar dois analitos e é representada pela expressão [9]:

N L h = 2 16       = W t N r

( ) ( )

[

]

Instrumentação

Para uma dada fase líquida a uma dada temperatura, a selectividade mantém-se independentemente do número de pratos teóricos da coluna. A resolução porém, é tanto maior quanto maior a eficiência da coluna [10].

As relações entre eficiência, selectividade e resolução, são complexas. A resolução está intimamente relacionada com as condições gerais de trabalho, através das variáveis controláveis num ensaio cromatográfico, segundo a equação [10]:

em que kB é o factor de capacidade relativo à espécie com menor velocidade ao longo da

coluna [9].

A resolução é fortemente dependente de α. Se α=1 os picos não podem ser resolvidos. Quanto maior for o valor de α maior é a resolução para um mesmo valor de N. Também o valor de kB tem influência decisiva na resolução. Quando kB→∞ o último termo

tende para 1, o que significa que para picos correspondentes a analitos pouco retidos é necessário um maior número de pratos teóricos. A zona de resolução óptima encontra-se na gama de valores de kB compreendidos entre 3 e 10. Acima deste limite, a resolução não

aumenta significativamente, enquanto o tempo de análise é consideravelmente alargado. Uma conclusão importante a tirar da equação acima é que a resolução apenas aumenta com a raiz quadrada de N. Deste modo, o comprimento da coluna tem de aumentar quatro vezes para que se obtenha o dobro da resolução. Assim, para misturas de componentes de separação mais difícil, a manipulação de α, pela escolha de fases estacionárias de maior

selectividade, em detrimento do aumento do comprimento da coluna, é uma decisão mais sensata [10].