GENES DIFERENCIALMENTE EXPRESSOS EM BACTERÓIDES DE

As plantas utilizadas nesse trabalho para análise do transcriptoma do rizóbio NGR234 apresentam diferentes características, como por exemplo, o tipo de nódulo (determinado ou indeterminado), a resposta ao sistema de secreção tipo três (TTSS) (positiva ou negativa), entre outras (TABELA 9). Devido a essas diferentes características foram construídas três tabelas (1. P. vulgaris vs. T. vogelii; 2. P.

vulgaris vs. V. unguiculata e, 3. T. vogelii vs. V. unguiculata) buscando encontrar os

genes que são diferencialmente expressos e que possam ser responsáveis pelas diferentes características. Para a análise dos genes diferencialmente expressos (GDE) entre as bibliotecas do rizóbio, quando associado com as plantas, foram selecionados apenas os genes que apresentavam uma cobertura igual ou maior que 3 vezes, em pelo menos uma das bibliotecas. Esses genes foram analisados no

software DE-Seq que gerou, a partir do número de leituras de cada gene, um valor

de fold change e um valor de P ajustado. As listas finais de expressão diferencial continham os genes com valor de fold change (variação de expressão) maior ou igual a 2, ou menor ou igual a -2, cobertura maior que 3 em uma das duas comparações e valor de P com confiança de 95% (p-value <0,05). Alguns genes que seriam removidos das listas devido aos valores de fold change, cobertura ou valor de P, mas que estavam próximos a linha de corte e faziam parte de um operon com genes diferenciais, foram incluídos nas tabelas.

TABELA 9: PRINCIPAIS CARACTERÍSTICAS QUE DIFERENCIAM AS TRÊS PLANTAS ESTUDADAS NESTE TRABALHO

Phaseolus vulgaris Tephrosia vogelii Vigna unguiculata

Tipo de nódulo Determinado Indeterminado Determinado

Resposta ao TTSS Negativa Positiva Indiferente

Após a aplicação dos parâmetros para gerar as listas finais de expressão diferencial, obteve-se três tabelas com uma média de 270 genes diferencialmente expressos em cada uma. Entre a comparação de P.vulgaris e T. vogelii (PHA-TEP) o

número total de GDE foi 231, sendo 125 com maior diferença de expressão em P.

vulgaris e 106 em T. vogelii. Os genes que apresentaram os maiores fold change em P. vulgaris codificam proteínas da classe dos transportadores ABC, diferente dos

genes com maiores fold change em T. vogelii, que codificam moléculas para a biossíntese de tiamina, do operon pqq (pirroloquinolina quinona), operon thu (transporte de trealose) e operon paa (metabolismo de ácido fenilacético). A tabela resultante da comparação entre P.vulgaris e V. unguiculata (PHA-VIG) gerou 319 genes com expressão diferencial, sendo 172 deles com maior diferença de expressão em P. vulgaris e 147, em V. unguiculata. Os genes com maiores fold

change em P. vulgaris codificam proteínas envolvidas com o sistema de secreção

tipo três e com a síntese de lipopolisacarídeos de superfície. Em V. unguiculata o maior fold change é de genes envolvidos com o transporte de cobalto e alcanosulfonato, e também do operon pqq. Por fim, a tabela dos GDE entre T. vogelii e V. unguiculata (TEP-VIG) possui 270 genes, sendo 167 com maior diferença de expressão em T. vogelii e 103 em V. unguiculata. Os genes com maior fold change em T. vogelii também codificam proteínas envolvidas com o sistema de secreção tipo três e com os lipopolisacarídeos de superfície, assim como em P. vulgaris na comparação PHA-VIG. Já em V. unguiculata são os genes codificando oxiredutases que estão com maior fold change. É notável a repetição de genes entre as comparações das bibliotecas. Isso sugere que uma característica comum a essas plantas pode ser responsável por esses resultados. Outro fato que é notável é que a presença de genes envolvidos com o sistema de secreção tipo três e com lipopolissacarídeos não está relacionado com os diferentes tipos de nódulos, já que os genes estão sempre menos expressos em V. unguiculata quando comparada com as outras duas plantas, P. vulgaris e T. vogelii. As possíveis razões para esses resultados serão detalhados e discutidos a seguir. Na tabela 10 é mostrado um resumo dos resultados gerados da obtenção dos genes diferencialmente expressos, e nos apêndices 1, 2 e 3 se encontram todos os genes diferencialmente expressos entre as três comparações. A identificação e a localização dos genes em cada

replicon é feita através do locus tag que são sistematicamente aplicadas a todos os

genes em um genoma dentro do contexto de projetos de sequenciamento. Os genes de S. fredii NGR234 que se localizam no cromossomo são identificados no locus tag através da letra ‘c’: NGR_c0000. Os genes localizados no mega plasmídeo ou plasmídeo b são identificados no locus tag através da letra ‘b’: NGR_b0000, assim

como, os genes que se encontram no plasmídeo simbiótico ou plasmídeo a são identificados pela letra ‘a’: NGR_a0000.

TABELA 10: RESULTADOS PARCIAIS DAS LISTAS DOS GENES DIFERENCIALMENTE EXPRESSOS. Comparação entre as bibliotecas Número de GDE total

Regulação dos genes

Genes com maiores diferenças nos níveis de expressão (fold change)

PHA - TEP 228

125 com maior fold change

em PHA Transportadores ABC 103 com maior fold change

em TEP

Operon pqq, thu, paa, biossíntese de tiamina

PHA - VIG 316

169 com maior fold change em PHA

LPS: rmlBDA, wbgA, TTSS, nopP, nolU, nodU, nodS,

syrM2, nodD2

147 com maior fold change em VIG

Operon pqq, transporte de alcanosulfonato - ssu e cobalto

- ctbAB

TEP - VIG 270

167 com maior fold change em TEP

LPS: rmlBDA, wbgA, TTSS, nopP, nolU, nodU, nodS,

syrM2, nodD2

103 com maior fold change em VIG

Oxiredutase, biossíntese de glutamina

NOTA: Genes diferencialmente expressos (GDE) entre P. vulgaris e T. vogelii: PHA-TEP; GDE entre P. vulgaris e V. unguiculata: PHA-VIG; GDE entre T. vogelii e V. unguiculata: TEP-VIG. Lipopolisacarídeos: LPS; Sistema de secreção tipo três: TTSS.

Após obtenção das tabelas, os genes foram submetidos a uma análise no KAAS – KEGG, uma das ferramentas utilizadas para analisar e direcionar esses genes e suas relações com a nodulação em cada planta.

5.3. ANÁLISE DOS GENES DIFERENCIALMENTE EXPRESSOS NO KAAS –