Genes nucleares e mitocondrial

2.3.1.1 Genes EF1, Globina e 18S

Para o desenvolvimento de novos marcadores nucleares, fragmentos dos genes nucleares EF1, Globina e 18S foram amplificados através de PCR utilizando-se pares de primers foward (F) e reverse (R) para cada região nuclear (Tabela 2).

As amplificações destes fragmentos gênicos foram realizadas basicamente em um volume total de 25 μl contendo 150 μM de cada dNTP (dATP, dTTP, dGTP e dCTP), MgCl2 1.5 mM, tampão da Taq 1X(20 mM Tris-HCl, pH 8.4 e 50 mM KCl), 0.5 unidades (U) da enzima Taq polymerase (Invitrogen), 0.1 a 0,2 μM de cada primer e 10-50 ng de DNA genômico. Estas reações foram realizadas no termociclador Mastercycler personal (Eppendorf), basicamente sob as condições de desnaturação a 95°C por 40s, hibridização de 52°C por 40s e extensão a 72°C por 20s, com 35 repetições.

21 Tabela 2. Sequências dos primers utilizados na amplificação dos fragmentos dos genes nucleares e gene mitocondrial.

*Sequência na ordem de 5’ para 3’, Silu: Siluriformes, F:Forward, R:Reverse.

2.3.1.2 Purificação dos produtos amplificados por PCR

Foi utilizado o protocolo de purificação de DNA tendo por base o kit comercial Protocolo do PEG (PolyEthylene Glycol) desenvolvido por Travis Glenn, disponível no endereço <http://www.uga.edu/srel/DNA_Lab/PEG_Precip’00.rtf>:

1 adicionar 25 µl de polietileno glicol (PEG) 20%-NaCl 2,5 M ao produto de PCR amplificado (25 µl). Misturar com a pipeta várias vezes;

2 colocar a 37ºC em estufa ou termociclador por 15 minutos; 3 centrifugar a 14.000 rpm por 15 minutos a temperatura ambiente; 4 descartar o sobrenadante;

5 adicionar 63 µl de álcool etílico 80% e esperar 2 minutos; 6 centrifugar a 14.000 rpm por 1 minuto a temperatura ambiente; 7 descartar o sobrenadante;

8 adicionar 63 µl de álcool etílico 80% e esperar 2 minutos; 9 centrifugar a 14.000 rpm por 1 minuto a temperatura ambiente; 10 descartar o sobrenadante;

11 secar em estufa a 37ºC por cerca de 10 minutos;

12 eluir em TE (100 mM Tris-CL e 10 mM EDTA - pH 8.0) adicionando 12,5µl e aguardar pelo menos 30 minutos antes de utilizar o produto limpo.

Primer Sequencia* Referências

RAG2 Silu F CCTGAGTGCTACCTATTCATGGA

Prado et al., 2011a RAG2 Silu R CTTGGGAGGAGAGACCATC

EF1α 835 F ATTGGAACTTACCTGTGG

Moyer et al., 2004 EF1α 1417 R CAGCCTTCTGTGCAGACTT

NS1 F GTAGTCATATGCTGTCTC White et al., 1990 18S Silu R CCATCGAAAATTGATAGGG presente trabalho Glob Silu F TCAATATGGTTCATGGACAGA

presente trabalho Glob Silu R CCAGAAGCTGAAAGTAGACAGT

16S F ACGCCGTTTATCAAAAACAT

Palumbi, 1996 16S R CCGGTCTGAACTCAGATCCGT

22 2.3.1.3 Reação de amplificação para o sequenciamento

Os produtos amplificados e purificados foram utilizados como moldes para as reações de sequenciamento com o kit DYEnamic Terminator Cycle Sequencing (Amersham Biosciences), utilizando o primer forward para cada gene. Para cada sequência gênica realizou-se uma réplica. A reação de sequenciamento seguiu os seguintes parâmetros: um ciclo inicial a 95ºC por 2 min, e 25 ciclos de 95ºC/45s, 50ºC/30s e 60ºC/2min. Em cada reação foram utilizados 3 l de produto da PCR, 2 l de tampão da reação (buffer), 2 l de pré-mix e 2 l do primer foward (3 M).

2.3.1.4 Limpeza dos fragmentos marcados

Na limpeza dos fragmentos resultantes do processo de amplificação procedeu-se do seguinte modo:

1 adicionar 1,0 µl de acetato de sódio 1,5M/EDTA 250 mM a cada tubo; 2 adicionar 80 µl de etanol 95% para cada reação e misturar no vórtex; 3 centrifugar a 16.000 rpm por 20 minutos a 4ºC;

4 remover o sobrenadante por aspiração; 5 adicionar 400 µl de etanol 70%;

6 centrifugar a 16.000 rpm por 10 minutos a 4ºC; 7 remover o sobrenadante por aspiração;

8 deixar secar na estufa a 37ºC por 30 minutos, protegido da luz.

As sequências foram determinadas no seqüenciador automático ABI PRISMTM 377 DNA Sequencer (Perking-Elmer) e posteriormente foram depositadas no GenBank do National Center of Biotechnology Information (NCBI).

2.3.1.5 PCR-RFLP

As regiões sequenciadas dos genes Globina, EF1 e 18S foram submetidas ao programa NEBcutter V2.0 (Vincze et al., 2003) para gerar mapas de restrição, tornando possível encontrar enzimas específicas para as espécies parentais analisadas. Os produtos do PCR foram submetidos à restrição enzimática em um volume final de 8 μl contendo 5 μl dos produtos de PCR, tampão da enzima 1X e 5 unidades de enzima de restrição (10 U/μl) (New

23 England Biolabs Inc.). O material das reações foi incubado por 2 horas de acordo com a temperatura ideal de cada enzima.

2.3.1.6 PCR-Multiplex

As sequências parciais dos genes Globina e EF1 foram alinhadas através do programa ClustalW (Thompson et al., 1994) implementado no programa BIOEDIT (Hall, 1999) para verificar pontos de mutação, a partir dos quais foram desenhados os primers espécie- específicos. As condições ideais dos primers foram analisadas através do programa NetPrimer disponível no site do PREMIER Biosoft International <http://www.premierbiosoft.com/netprimer>.

Para as amplificações multiplex foram utilizados, na mesma reação, tanto os primers foward e reverse (Tabela 2) como os primers espécie-específicos desenvolvidos para as espécies parentais, de acordo com o gene a ser analisado. As reações inicialmente foram realizadas em uma concentração de aproximadamente 150 μM de cada dNTP, MgCl2 1.5 mM, tampão da Taq 1X, 0.5 unidades de Taq polymerase (Invitrogen), 0.1 a 0,4 μM de cada primer e 10-50 ng de DNA genômico (total de 25 μl). As amplificações foram realizadas no termociclador Mastercycler personal (Eppendorf) basicamente sob as condições de desnaturação a 95°C por 40s, hibridização de 50 a 58°C por 40s e extensão a 72°C por 10 a 20s, com 35 repetições.

Para os genes onde foram desenvolvidas ambas as técnicas, a PCR-multiplex foi utilizada em primeiro lugar, seguida pela PCR-RFLP em análises subsequentes para confirmação dos resultados. Três amostras de DNA de cada espécie parental, previamente identificadas como puras, foram utilizadas como controle de especificidade de todas as reações. Os fragmentos de DNA das análises PCR-multiplex e PCR-RFLP foram visualizados em gel de agarose 1,5% corado com brometo de etídio (1 ng/ml) ou SYBR Safe™ (Applied Biosystems), utilizando o DNA ladder de 1 Kb (Invitrogen).

2.3.1.7 Genes RAG2 e 16S

Na PCR-RFLP os fragmentos de genes RAG2 e 16S foram amplificados por PCR utilizando os primers descritos na tabela 2 e utilizando as enzimas Sau96I (RAG2) e SmlI (16S) seguindo as mesmas etapas de clivagem enzimática (tópico 2.3.1.5). No multiplex-PCR,

24 além dos iniciadores para cada gene (Tabela 2), foram utilizados os primers espécie- específicos RAG2Pc R (5’-AACTCCAGGTCAATGAGATAAATG-3’) e RAG2Pr R (5’- CAGTTCCAGGTCTCTGTGGTT-3’) para o gene RAG2 e 16SPc F (5- TGACCATAAAGATCCGGCTAT-3’) e 16SPr R (5’-TCTTGGTTTTGGGGTTGTTA-3’) para o gene 16S (Prado et al., 2011a). As condições dos programas e concentração das amplificações por PCR seguiram o indicado por Prado et al. (2011a) enquanto a análise em gel de agarose seguiu as mesmas etapas descritas anteriormente.