CÁLCULO DA CONCENTRAÇÃO DO DNA
O DNA estocado e utilizado para esta pesquisa foi quantificado pela leitura de densidade ótica, utilizando o aparelho Nano drop, um spectrofotômetro de espectro completo (190 a 840 nm) de alta acurácia e reprodutibilidade, utilizando somente 1 µL de cada amostra.
AMPLIFICAÇÃO DA REGIÃO 3’ NÃO TRADUZIDA DO ÉXON 8 DO HLA-G
O processo de amplificação da região 3’ UTR localizada no éxon 8, contou com os mesmos oligos iniciadores, abaixo relacionados, utilizados por SARTURI, 2005 o qual investigou a variação nos éxons 2, 3 e 8 de HLA-G, e sua relação com o abortamento recorrente, em estudo realizado pelo grupo de pesquisa do também realizada no Laboratório de Imunogenética e Histocompatibilidade (LIGH).
posição 5’ GTGATGGGCTGTTTAAAGTGTCACC; posição 3’ GGAAGGAATGCAGTTCAGCATGA.
As reações de PCR, para cada amostra, seguiram de acordo com as seguintes condições: DNA molde na concentração 100ng por reação; tampão BUFFER 10X na quantidade de 1x; dNTPs na concentração de 0,10mM; oligonucleotídeos iniciadores na concentração de 10pM/cada por reação, MgCl2 1 mM; Taq Platinum Invitrogen 2U, e água ultrapura q.s.p. 50µl.
As condições de ciclagem a que foram submetidas as amostras são as seguintes: desnaturação inicial a 94ºC por 2 minutos; desnaturação também a 94ºC por 30 segundos; anelamento dos primers a 64ºC por 1 minuto; alongamento por 2 minutos a 72ºC, e alongamento final também a 72ºC por 10 minutos. Foram 35 ciclos utilizando o aparelho Termociclador GeneAmp PCR System 9700 (P.E.).
ANÁLISE DOS FRAGMENTOS AMPLIFICADOS DA REGIÃO 3’ NÃO TRADUZIDA DO ÉXON 8 DO HLA-G
Após a amplificação dos fragmentos, os mesmos foram separados por corrida eletroforética em gel de poliacrilamida a 8%. O procedimento seguiu o seguinte protocolo para a síntese do gel: 8 ml de poliacrilamida; 22 ml de tampão TBE 1x; 250 µL de persulfato de amônia, e 30µL de TEMED.
As amostras correram por 2 horas e 30 minutos a uma voltagem de 100V, e foram coradas com coloração de prata. Foram obtidos fragmentos com 210pb e com 224 pb correspondendo a alelos com a inserção de 14pb e alelos com a deleção de 14 pb (Figuras 5 e 6).
FIGURA 5 – GEL DE POLIACRILAMIDA/FRAGMENTOS INS/DEL 14pb REGIÃO 3’UTR DE HLA-G.
Figura 5. Detecção do polimorfismo 14bp Ins/Del em gel de poliacrilamida. O alelo Ins14pb (+14pb) origina um produto de PCR de 214pb enquanto o alelo Del14pb (-14pb) origina um produto de PCR de 210pb. Atribuição de genótipos: homozigoto (+14pb/+14pb); heterozigoto (+14bp/-14bp); homozigoto (-14/-14bp).
AMPLIFICAÇÃO DA REGIÃO REGULADORA E PROMOTORA ENTRE AS POSIÇÕES -1446 A - 304 DO GENE HLA – G
Primeiramente as amostras foram diluídas para a concentração de 25 µg/µL, em um volume final de 70µL, sendo estas as amostras de uso, permanecendo as amostras na concentração original em estoque.
Após este procedimento, segue a amplificação do segmento de DNA compreendido entre as posições -1446 e – 304 do gene HLA-G. Os oligonucleotídeos iniciadores (primers) selecionados (Tabela 6) para realizar a amplificação, e posterior reação de seqüenciamento da região alvo, foram fundamentados no protocolo utilizado por OBER et al., (2003), o qual estudou os polimorfismos da região promotora do gene HLA–G em casais da população Hutterite. O oligonucleotídeo iniciador *G -830R sofreu modificações na orientação Forward para Reverse , sendo isto necessário para atender o critério proposto por SILVA, (2009) em estudo similar ao atual, o qual determinava a análise de fragmentos de tamanho e número de pares de bases similares (aproximadamente 600 pb).
O oligonucleotídeo iniciador G* -919F foi especialmente desenhado para o trabalho desenvolvido por SILVA, (2009), o qual foi também utilizado nesta presente pesquisa. O desenho e a síntese deste último oligo iniciador, permitiu a obtenção de um padrão de tamanho de fragmentos” compatível com o equipamento Genetic Analyser – ABI3110, usado na rotina laboratorial do LIGH.
TABELA 10 - OLIGONUCLEOTÍDEOS INICIADORES Oligos Iniciadores Sequência Temperatura de Anelamento Tamanho do Fragmento Região Amplificada G* -1446F ACATTCTAGAAGCTTCACAAGAATG 60º C 638pb Reguladora Intensificadora G* -830R CGTAGCCCTAAGTTTCCGTGTG 60º C 638pb Reguladora Intensificadora G* -919F CTGTGAGGTGAATAAAGTTTGTGC 65º C 637pb Reguladora Intensificadora G* -304R GCCAAGCGTTCTGTCTCAGTGT 65º C 637pb Reguladora Intensificadora
Os oligonucletídeos foram testados utilizando programas disponíveis no site http://genome.ucsc.edu/, para certificação de que o anelamento dos mesmos se mostrava específico para a região reguladora de HLA-G:
ACATTCTAGAAGCTTCACAAGAATGaggtggagccactggagtgttttaggtggagaaatgacacactctgactcatagtagc aggaccactatagagagaacactcatgtagcaggtcatggaacagtgctagagccacaattcaggagtgagagggtggtggggattaagg ggagaagagggcctgagggatgagagggacggagggaagggctggaggagcaggaggtgaggaaaaggagcagaggaaagaattc caaagcagcggaactcttaggtttaaacacattgttttatagattttattacatccatctacagagcctcgctgggtgttctttgcagttggcctttaatat cttatgtgggtctgcctagaaactaattgttttttatgttaatcaggtttaaaaaatactaagtattcctaaaaaatatacactccactcacatgtggata cttcctaaaaacaggcagtgcatgagcactagtgaggggcattgtgactgcactgaacacttacaactgtgaggtgaataaagtttgtgctggct cctggttgcaacatatagtaacatagtgtggtactttgtcttgaggagatgtcctggactcacacggaaacttagggctacggaatgaaggtaaat ttaaaataaaacaagcgggagtcacagatacattgtctgggaaagtgaaacttaagagctttgtgagtcctgttgtaaggcttttagatgcatttat ataccaacgggccaaagtcacattttttacctattagattcctgatcattcaggggttaccaagattatgctacccactatagttaataaacaaaaa gcaaactggtctctattctatctcatgcactcaggcacaacttttccagatttaagggggaaaaaaaaccctgtctttacacctacaatcccaggg cgagctcactctctggcaccaagctccgtggggtgatttttcttctagaagagtacaggaggacaggcaaggagtgggaggcagggagtcca gttcagggacagggattccgggatgaaaagtgaagggagagggacagggaccttgccgagggtttctccctggtttctcagacagctcctgg gccaagactcagggagacactgagacagaacgcttggcacaagagtagcggggtcagggcgaagtcccagggcctcaagcgtggctctc Figura 2-Região reguladora/promotora de HLA-G, sequências nucleotídicas marcadas com cores diferentes correspondem aos oligonucleotídeos presentes na tabela 8 utilizados para a amplificação da região.
A reação de PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) foi realizada para cada amostra de DNA, e para cada par de primer de forma separada. Para tanto, a técnica foi otimizada partindo-se de um protocolo base sugerido na bula da Taq Platinum Polymerase. Após vários ajustes, a fim de utilizar a menor quantidade possível de reagentes e obtendo-se um resultado de alta qualidade na amplificação das amostras, as reações de PCR seguiram de acordo com as seguintes condições, com algumas variações entre estes dois fragmentos: Fragmento 1 (-1446F/ -830R), DNA molde na concentração 100ng por reação; tampão BUFF 10X na quantidade de 1x; dNTPs na concentração de 0,10mM; oligonucleotídeos iniciadores na concentração de 7,5pM/cada por reação, MgCl2 2 mM; Taq Platinum Invitrogen 2U, e água ultrapura q.s.p. 50µl. Fragmento 2 (-919/ - 304), DNA molde na concentração 100ng por reação; tampão BUFF 10X na quantidade de 1x; dNTPs na concentração de 0,10mM; oligonucleotídeos iniciadores na concentração de 5 pM/cada por reação, MgCl2 1,5 mM; Taq Platinum Invitrogen 2U, e água ultrapura q.s.p. 50µl.
O processo de ciclagem é realizado em sequência, iniciando-se com a desnaturação inicial a 94º C por 5 minutos; em seguida a desnaturação também a
94ºC, porém por 30 segundos; a seguir o anelamento a 60ºC (Fragmento 1) e a 65ºC (Fragmento 2) por 30 segundos; alongamento a 72º C por 3 minutos; e por fim o alongamento final também a 72º C por 5 minutos. Ao todo são 35 ciclos, utilizando o Termociclador GeneAmp PCR System 9700 (P.E.).
PURIFICAÇÃO DAS AMOSTRAS AMPLIFICADAS PARA A REGIÃO REGULADORA/PROMOTORA DE HLA-G.
Os produtos amplificados das regiões -1446/ -830 e -919/-304 passaram por dois processos de purificação. O primeiro foi com base no acetato de amônio, procedendo-se da seguinte forma: 50µL do produto de PCR; 27µL de acetato de amônio 7,5M; 167,5 µL de etanol absoluto. As amostras seguiam para a centrifugação a 14000 rpm por 30 minutos. O sobrenadante era descartado e então adicionava-se 100µL de etanol 70%, e nova centrifugação por 30 minutos a 14000 rpm; descarte do sobrenadante e secagem em estufa a 40º C.
A seguir as amostras eram ressuspendidas em 18 µL de água ultrapura, otimizando desta forma a concentração do produto de PCR.
As amostras passavam por uma nova reação de purificação enzimática para retirada de primers e outras impurezas utilizando: Exonuclease I (EXO I) – Amersham Biosciences – E70073Z (2.500U) e Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP), Amersham Biosciences – E70092X (5000U). Para cada amostra foram utilizados 6U de EXO; 2,4 U de SAP; 0,3 µL de tampão, e 18 µL de produto de PCR.
Esta preparação era submetida ao termociclador por 1 hora a 37ºC, e 15 min a 80ºC. Após esta etapa, o produto está pronto para a reação de seqüenciamento.
REAÇÃO DE SEQUENCIAMENTO DA REGIÃO
REGULADORA/PROMOTORA DE HLA-G
As amostras foram então submetidas à reação de seqüenciamento de forma separada para cada primer, seguindo-se o procedimento: amostra de DNA amplificada e purificada na concentração de 100ng por reação; primer de seqüenciamento na concentração de 1,6 pM – 1,6 µL; Big Dye v3.1 - 1µL; save tampão – 0,5 µL.
A seguir, a reação de ciclagem ocorria por meio das seguintes etapas: desnaturação inicial a 96ºC por 1minuto, desnaturação a 96ºC por 15 segundos, anelamento dos primers a 54ºC por 15 segundos, e alongamento a 60ºC por 4 minutos. Estas etapas ocorrem 35 vezes (35 ciclos).
PRECIPITAÇÃO
Após a reação de seqüenciamento, as amostras eram submetidas a um processo de precipitação de acordo com o protocolo: 2µl de acetato de sódio (TA), 25 µl de etanol absoluto (TA), Vortex intenso por 30 seg., centrifuga em 4000 rpm por 40 min., spin invertido 800 rpm por 10 seg. (em papel toalha), 50 µL de etanol 80% (TA); centrifuga 4000 rpm por 10 min; spin invertido 800 rpm por 10 seg; secagem 5 min à 60ºC em termociclador.
Guardar a -20ºC ou descongelar formamida e: 15 µl de formamida – vortex rápido + spin de 800 rpm 10 seg; desnaturar por 3 min a 95ºC; choque térmico no gelo por 40 seg; levar ao sequenciador.
O produto foi analisado no seqüenciador automático ABI-310 Applied Biosystems.
CARACTERIZAÇÃO DAS SNPs DA REGIÃO REGULADORA/ PROMOTORA DE HLA-G.
Através do seqüenciamento de 1200 pb (FIGURAS 6 e 7) da região reguladora e promotora de HLA-G foi possível identificar 15 SNPs, todos já descritos por OBER et al., 2003. Novos SNPs foram investigados através do programa ASSIGN SBT 3.2.7, porém não foram encontradas novas variantes.
As amostras foram analisadas com o apoio do programa Bio Edit Sequence Alignment Editor.
FIGURA 6 - ELETROFEROGRAMA DO FRAGMENTO1 DE HLA-G