GENOTIPAGEM E SEQUENCIAMENTO

A RT-PCR demonstrou positividade em seis amostras (6/279–2,1%) com três delas submetidas ao sequenciamento automático, em razão do restante apresentar amplificação muito fraca e ficar impossibilitado para análise. As amostras sequenciadas foram classificadas nos genótipos I2, G4, P[2] e E2 para os genes VP6, VP7, VP4 e NSP4, respectivamente, e nas análises aminoacídicas foram utilizadas as regiões codificantes de cada gene.

O sequenciamento de nucleotídeos para o gene VP6 demonstrou agrupamento no genótipo humano I2 circulante no período de 2008 com similaridade entre as mesmas de 99,5 a 100% para nucleotídeos (nt) e de 98,4 a 100% para aminoácidos (aa). Tais amostras ficaram agrupadas no mesmo braço com outras do Japão (OH567), China (YNR001) e Índia (V508 e V460) com similaridades de nt ≥ 98% e de aa ≥ 98,4%.

Foram também observadas similaridade de nt de 99 a 100% e aa de 100% para amostras de RVC que circularam no Brasil nos anos de 2008 como SP28 e SP36. Já em Belém, Brasil, circularam as seguintes cepas: Belém, PA23997-34, PA24002-75 e PA24357-23 com similaridades de nt ≥ 96,5% e aa ≥ 93,5%. Esses dados estão apresentados no dendrograma de classificação genética do gene VP6 das amostras positivas observado na FIGURA 15.

As amostras do presente estudo com genótipo I2 não apresentaram substituições aminoacídicas na região codificante.

FIGURA 15: Dendrograma demonstrando a classificação genética do gene VP6 das amostras positivas para RVC em fezes de crianças hospitalizadas com gastrenterite entre maio/2008 a abril/2011 em Belém-PA. As representações das amostras desse estudo estão organizadas da seguinte forma: Vírus (RVC)/origem do hospedeiro (Hu)/país de coleta (Brasil)/código da amostra/anos de coleta/genótipo.

Para o gene VP7, as mesmas agruparam-se no genótipo humano G4 circulantes no período de 2008, com similaridade, entre as mesmas de 99,7 a 100% para nt e de 100% para aa. Agruparam-se no mesmo braço das amostras do Japão (Y08-3) e Colombia (Javeriana) com similaridades de nt ≥ 99,7% e de aa de 100%. Apresentaram, também, similaridade de nt ≥ 94,2% e aa ≥ 93,5% nas cepas do Brasil, Belém, 6325 e 10007 circulantes nos anos de 1989, 2003 e 2004, respectivamente (FIGURA 16).

FIGURA 16: Dendrograma demonstrando a classificação genética do gene VP7 das amostras positivas para RVC em fezes de crianças hospitalizadas com gastrenterite entre maio/2008 a abril/2011 em Belém-PA. As representações das amostras desse estudo estão organizadas da seguinte forma: Vírus (RVC)/origem do hospedeiro (Hu)/país de coleta (Brasil)/código da amostra/anos de coleta/genótipo.

As amostras do estudo apresentaram seis substituições aminoacídicas quando comparadas com o protótipo Bristol, sendo elas: posições 37 (I→M); 49 (G→C); 53 (T→I); 169 (R→K); 215 (A→V), apenas na amostra 2A0059; e 259 (I→V). A sequência codificante do gene VP7 destaca a ocorrência das substituições de aa nas amostras positivas para RVC (FIGURA 17).

FIGURA 17: Sequências aminoacídicas do gene VP7 das amostras do presente estudo, protótipo, amostras do Brasil e do mundo. Os retângulos vermelhos indicam as substituições dos aa identificadas. Siglas dos aa encontram-se no anexo B.

Já para o gene VP4, as amostras agruparam no genótipo humano P[2] circulantes no período de 2008, com similaridade, entre as mesmas de 99,6 a 100% para nt e 100% para aa.

Essas amostras agruparam no mesmo braço com amostras da Índia (V508) e Bangladesh (BS347) com similaridades de nt ≥ 97,4% e de aa ≥ 98%. As cepas que circularam no Brasil (6325, 1007 e Belém) nos anos de 2003, 2004 e 1989, respectivamente, e apresentaram similaridades de nt ≥ 94,9% e aa ≥ 97,4% (FIGURA 18).

As amostras do estudo apresentaram 12 substituições aminoacídicas quando comparadas com o protótipo Bristol, sendo elas: posições 31 (V→I); 55 (I→T); 124 (T→A); 129 (N→D), 132 (N→T); 139 (D→V); 181 (R→K); 224 (S→N); 238 (A→V); 241 (V→I); 243 (M→I), 252 (N→I). Destacam-se os resíduos das posições 55 e 243 por apresentarem-se apenas nas amostras circulantes na região Amazônica brasileira. As substituições de aa ocorridas nesse gene nas amostras do presente estudo estão destacadas na FIGURA 19.

FIGURA 18: Dendrograma demonstrando a classificação genética do gene VP4 das amostras positivas para RVC em fezes de crianças hospitalizadas com gastrenterite entre maio/2008 a abril/2011 em Belém-PA. As representações das amostras desse estudo estão organizadas da seguinte forma: Vírus (RVC)/origem do hospedeiro (Hu)/país de coleta (Brasil)/código da amostra/anos de coleta/genótipo.

Fonte: Elaborado pela autora (2014).

P[2]

P[1] P[3]

FIGURA 19: Sequências aminoacídicas do gene VP4 das amostras do presente estudo, protótipo, amostras do Brasil e do mundo. Os retângulos vermelhos indicam as substituições dos aa identificadas. Siglas dos aa encontram-se no anexo B.

Para o gene NSP4, as amostras do presente estudo agruparam no genótipo humano E2 circulantes no período de 2008, com similaridade, entre as mesmas de 99,6 a 99,8% para nt e 99,3 a 100% para aa. Agruparam-se no mesmo braço da amostra do Brasil (IAL-rc33), do Japão (BK0830) e China (Wu82 e OH567) com similaridades de nt ≥ 97,7% e de aa ≥ 97,3%. As demais cepas do Brasil (10007 e 6325) tiveram pouca similaridade com as amostras do estudo apresentando nt ≥ 67,5% e aa ≥ 93,8% (FIGURA 20).

FIGURA 20: Dendrograma demonstrando a classificação genética do gene NSP4 das amostras positivas para RVC em fezes de crianças hospitalizadas com gastrenterite entre maio/2008 a abril/2011 em Belém-PA. As representações das amostras desse estudo estão organizadas da seguinte forma: Vírus (RVC)/origem do hospedeiro (Hu)/país de coleta (Brasil)/código da amostra/anos de coleta/genótipo.

As amostras sob análise para o gene NSP4 apresentaram duas substituições aminoacídicas quando comparadas com o protótipo Bristol, sendo elas: posições 7 (S→L) e 15 (H→Q), este último foi observado apenas nas amostras do Brasil formando um grupamento regional, o qual é observado na sequência de aa em destaque na FIGURA 21.

FIGURA 21: Sequências aminoacídicas do gene NSP4 das amostras do presente estudo, protótipo, amostras do Brasil e do mundo. Os retângulos

vermelhos indicam as substituições dos aa identificadas. Siglas dos aa encontram-se no anexo B.