Como gerar um gradiente morfogenético: o papel de proteoglicanos

Passamos a considerar os mecanismos moleculares que poderiam estar envolvidos na geração do gradiente de Sog ao longo do eixo DV do folículo ovariano. Ao contrário dos mecanismos que regulam a difusão de outros morfógenos como Dpp, Wg e Hh terem sido intensamente estudados ao longo dos últimos anos, nenhum trabalho havia se proposto a explorar os mecanismos que atuam sobre a mobilidade de Sog. Como citado anteriormente, moléculas de PGHS têm sido apontadas como reguladoras da mobilidade de morfógenos. Decidimos, baseados nestas evidências, testar a hipótese do envolvimento de moléculas de PGHS na regulação da mobilidade/ atividade de Sog.

A análise do padrão de venação tem sido utilizada como uma importante ferramenta para a identificação, isolamento e análise de novos componentes de diversas vias de sinalização como EGF, BMP, Hedgehog, Notch e Wnt (revisado em Blair, 2006). Foi demonstrado que PGHS são capazes de ligar Cordina e de potencializar sua atividade antagônica sobre BMP, o homólogo vertebrado de Dpp (Jasuja. e cols., 2004). Foi demonstrado também que Cordina se liga aos PGHS de matriz extracelular como o Perlecan (Jasuja. e cols., 2004). Dada a similaridade de seqüência entre Cordina e Sog, estes dados sugeriam que Sog também fosse capaz de ligar PGHS e que esta ligação seria importante para a sua atividade.

Moléculas de heparan sulfato são sintetizadas durante o desenvolvimento da asa e apresentam o mesmo padrão espaço/temporal caracterizado para Sog.

Durante estágios iniciais da pupa (24 horas após a formação da pupa), Sog é capaz de invadir o domínio proveia e este movimento é dependente de integrina (Araujo e clos., 2003). Moléculas de heparan sulfato também apresentam a mesma dinâmica, invadindo a região da veia durante este mesmo período (fig.9), sugerindo que estas moléculas possam participar da movimentação de Sog.

Sog antagoniza Dpp durante o período pupal para assegurar a formação correta das veias, retas e contínuas (Yu e cols., 1996). Uma vez que a expressão de dpp dentro do domínio da veia é crucial para a manutenção do destino de veia nestas células em estágios avançados da pupa (Conley e cols., 2000), e que a expressão de sog é restrita às células da interveia (Yu e cols., 1996), para Sog exercer sua atividade antagônica sobre Dpp, é necessário que ele difunda a partir deste domínio para a região proveia. Como citado, a atividade de TTV (que tem sido descrito durante o alongamento da cadeia dissacarídica) foi mostrada ser importante para a movimentação de outros morfógenos. Dado que ttv interagiu com sog eliminando o truncamento das veias e durante a oogênese, será interessante testar a hipótese da participação de ttv na regulação da mobilidade de Sog. Este mesmo tipo de fenótipo de perda de truncamento também foi descrito para a ausência da subunidade de integrina αPS1, que está diretamente envolvida na mobilidade de Sog a partir do domínio interveia para o domínio veia (Araujo e cols., 2003). Para demonstrar a participação do produto do locus ttv na atividade de Sog, estão sendo construídas linhagens recombinantes ttv/FRT 42D. Através desta estratégia, serão gerados grupos de células que não expressam ttv durante o desenvolvimento da asa e oogênese. Através de imunomarcações com 8a e 8b seremos capazes de avaliar se haverá alguma alteração na mobilidade de fragmentos de Sog nos arredores destes grupos celulares.

PGHS estão presente em grande quantidade sobre a superfície celular e são responsáveis por gerar sítios de ligação de baixa afinidade para moléculas sinalizadoras secretadas como Wg/Wnt. Um dos modelos mais bem descritos para a interação entre morfógenos e PGHS é a interação entre Wg e glipicanos. Wg é capaz de se ligar a GAGs em células em cultura (Reichsman et al., 1996), e os proteoglicanos de superfície celular, Dally e Dally-like estão envolvidos neste processo. Notum, por sua vez, é capaz de alterar o gradiente morfogenético de Wg gerando modificações nestes glipicanos (Giraldez e cols., 2002). Notum codifica uma α/β hridrolase, uma superfamília de esterases que inclui peptidades, lipases esterase e uma variedade de enzimas hidrolíticas (Nardine e Dijkstra, 1999). A forte interação detectada entre sog e notum levantou a possibilidade da regulação da mobilidade de Sog por glipicanos. No entanto, não fomos capazes de detectar interação entre sog e dally, resultado que já havia sido mostrado por Araujo e colaboradores em 2003. Havia, no entanto, a possibilidade de sog interagir com

dally-like, o que faria uma ligação entre Sog e Notum, já que Notum também atua sobre Dally-like.

Não foi possível, no entanto, detectar interação genética entre sog e dally-like, permanecendo em aberto o elemento que possivelmente conectaria Sog e Notum.

A modificação de PGHS por sulfatação é extremamente relevante para sua função. A desacetilação e a sulfatação de parte dos resíduos de GlcNAc das unidades dissacarídicas dos GAGs de PGHS, pelas enzimas NDST, é necessária para a subseqüente epimerização e sulfatação, que enriquecem a diversidade estrutural e funcional das cadeias de GAGs. A enzima NDST de Drosophila é codificada pelo locus sulfateless. Células que não apresentam a atividade desta enzima apresentam redução nos níveis de Dally e Dally-like, redução na ligação de Wg e sensibilidade diminuída a Wg (Baeg e cols., 2001; Lin e Perrimon, 1999).

Apesar de não detectarmos interação entre sog ^EP7 e sfl, fomos capazes de detectar uma forte interação entre sog e slalom, que codifica um doador de sulfato de alta energia 3’fosfato5’fosfosulfato (PAPS). A sulfatação de moléculas secretáveis ocorre no aparelho de Golgi e necessita que este doador de alta energia PAPS esteja presente dentro desta organela. Em

Drosophila o PAPS é sintetizado no citoplasma pela PAPS sintase (Julien e cols., 1997). O PAPS

tem que ser transportado para dentro do Golgi (Lyle e cols., 1994) para servir como substrato para a sulfotransferase. Foi sugerido que a função de Slalom seja essencial para pelo menos dois tipos de sulfotransferase: Sulfateless e Pipe. Não fomos capazes de detectar nenhum tipo de interação entre sog e sulfateless no modelo da asa nem durante a oogênese. De forma alternativa, Slalon pode ser importante para sulfotransferases características de glicoproteínas, e neste caso poderia ser importante para a sulfatação de unidades dissacarídicas do próprio Sog.

Dados do screening sugerem que a polimerização das cadeias de GAGs, a sulfatação e a dinâmica de clivagem de PGHS de superfície celular podem ser importantes para a atividade biológica da interação entre Sog e Dpp no modelo da asa. O screening, no entanto, não é capaz de nos fornecer um dado comprovador da interação direta entre os produtos de loci gênicos testados. Isto é devido a algumas limitações desta técnica, como: a classe de alelo em teste no background EP e 2. o resultado do screening não indica a direção da interação (supressão X potencialização). Esta técnica, por outro lado, nos permite traçar de forma mais direta novas estratégias para desvendar a verdadeira relação entre as moléculas testadas.