GHIGGI, Liliam Daniela1 CAVASIN, Natália1 BOHNEBERGER, Gabriela2 RAMOS, Grasieli de Oliveira3 DALLANORA, Lea Maria Franceschi4 DALLANORA, Fábio José5 TRAIANO, Maria Luiza6
A bactéria Enterococcus faecalis tem sido muito estudada, pela frequente prevalência nos casos de retratamento endodôntico, devido a sua alta virulência. Este trabalho teve como objetivo avaliar a eficácia dos extratos glicólicos da própolis, da Punica granatum e do óleo essencial do Rosmarinus officinalis, comparando-os com a clorexidina, frente ao Enterococcus faecalis. Foram utilizados 12 tubos de ensaio, 2 tubos para cada grupo, totalizando 6 grupos: grupo 1 – placebo (água destilada estéril); grupo 2 – clorexidina 2%; grupo 3 – óleo essencial de Rosmarinus officinalis; grupo 4 – extrato glicólico de própolis 20%; grupo 5 – extrato glicólico de Punica granatum 10% e grupo 6 – composto apenas do meio de cultura sem adição de placebo ou qualquer outro produto. Após comprovada a contaminação, os tubos receberam 1ml de cada substância desafio e foram devolvidos à estufa bacteriológica e incubados por 24 horas. Decorrido o tempo de incubação o conteúdo dos tubos foi semeado em placas de Petry contendo meio de cultura. Após os tubos e as placas foram reincubados por mais 24 horas. Aos 10 dias de teste foi observado que os grupos 3, 4 e 5 apresentaram crescimento bacteriano, se mostrando ineficazes frente a Enterococcus faecalis, assim como o grupo placebo e o grupo 6 de acompanhamento. Somente o grupo da Clorexidina 2% apresentou efeito bactericida, sendo este constatado a partir do primeiro dia de incubação. Nas concentrações avaliadas, os extratos testados não apresentaram efeito bactericida frente a bactéria Enterococcus faecalis.
Palavras-chave: Endodontia. Enterococcus faecalis. Própolis. Rosmarinus Officinalis. Punicaceae.
1 INTRODUÇÃO
O profissional que executa o tratamento endodôntico deve ter sempre em mente que o seu maior desafio é realizar uma desinfecção eficaz dos canais radiculares, visto que, as infecções 1 Cirurgiã-dentista graduada pela Universidade do Oeste de Santa Catarina.
2 Graduanda em Odontologia pela Universidade do Oeste de Santa Catarina; gabibohne@gmail.com
3 Professora no Curso de Odontologia da Universidade do Oeste de Santa Catarina; grasieli.ramos@unoesc.edu.br 4 Professora no Curso de Odontologia da Universidade do Oeste de Santa Catarina; lea.dallanora@unoesc.edu.br 5 Professor no Curso de Odontologia da Universidade do Oeste de Santa Catarina; fabio.dallanora@unoesc.edu.br 6 Professora no Curso de Odontologia da Universidade do Oeste de Santa Catarina; maria.traiano@unoesc.edu.br
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endodônticas são mistas e polimicrobianas, isto é, compostas por mais de 100 espécies bacterianas potencialmente patogênicas (SIQUEIRA JÚNIOR, 1997). O Enterococcus faecalis é uma bactéria gram- positiva anaeróbia facultativa, comumente estudada na endodontia devido a sua alta resistência às substâncias químicas utilizadas nos procedimentos de limpeza e desinfecção dos canais, sendo que sua prevalência em canais radiculares com doença perirradicular persistente vem sendo relatada em diversos estudos, como o de Roças e Siqueira (2014), Maia Filho et al., (2008) e Nacif e Alves (2010).
Em consequência disso a terapia endodôntica tem como principal objetivo a eliminação de bactérias do sistema de canais radiculares, buscando obter a sua desinfecção por meio da instrumentação mecânica, ação química das soluções irrigadoras e da terapia medicamentosa intracanal, evitando que os microrganismos permaneçam e sustentem a periodontite apical, o que levará ao retratamento (FERREIRA, 2010). A medicação intracanal ideal, além de apresentar excelente ação antimicrobiana, precisa ser atóxica para não prejudicar os tecidos periapicais e as células do ligamento periodontal.
A clorexidina já vem sendo utilizada no tratamento endodôntico a diversos anos, por ser um antimicrobiano de largo espectro, capaz de eliminar microrganismos envolvidos na patogênese pulpar e periapical (MAIA FILHO et al., 2008). Uma das principais propriedades da clorexidina é a substantividade que segundo Hortense et al., (2010) é a sua capacidade de permanecer retida no local de ação ativa (superfície dentária, gengiva e mucosa bucal), sendo liberada lentamente. Essa propriedade a difere de outros desinfetantes, que rapidamente se dissipam e não têm efeito antibacteriano residual. No tratamento de canal a substantividade é significativamente importante, visto que, uma liberação gradual de clorexidina no interior do canal radicular pode tornar o ambiente bacteriostático por um período prolongado (MARION et al., 2013).
Por apresentarem potenciais terapêuticos e serem mais econômicas, os produtos naturais tem despertado cada vez mais o interesse da comunidade científica, uma delas é a própolis, uma mistura complexa produzida e utilizada pelas abelhas que possui excelentes propriedades antimicrobianas, garantindo um ambiente asséptico nas colmeias. A própolis também apresenta propriedade anti-inflamatória, antioxidante e antineoplásica (MENEZES, 2005).
O Rosmarinus officinalis, também conhecido como alecrim, é uma planta medicinal utilizada desde o século XVII e considerada eficaz para diversos fins medicinais por sua reconhecida ação antisséptica e anti-inflamatória, sendo que sua capacidade curativa é obtida utilizando os extratos das folhas e flores da planta (LORENZI et al., 2002).
A Punica granatum L. popularmente conhecida como romã, é uma planta de pequeno porte originária da Ásia e espalhada em toda a região do mediterrâneo, atualmente cultivada em quase todo o mundo, inclusive no Brasil (LORENZI et al., 2002). De acordo com Brito (2010), os estudos relacionados à inibição da aderência, sugerem que o uso de fitoterápicos pode ser uma opção viável ao controle de diferentes espécies microbianas. A literatura relata diversas espécies, distribuídas em diferentes famílias botânicas como úteis no tratamento de afecções odontológicas, dentre as espécies citadas encontra-se a Punica granatum L. (ARGENTA et al., 2012).
Há muitos anos pesquisadores vem buscando por uma medicação intracanal que respeite os requisitos biológicos e terapêuticos, principalmente contra o Enterococcus faecalis. O objetivo deste
Artigos 77 trabalho foi avaliar a eficácia dos extratos glicólicos da própolis, da Punica granatum e do óleo essencial do Rosmarinus officinalis, comparando-os com a clorexidina, frente ao Enterococcus faecalis.
2 METODOLOGIA
Trata-se de uma pesquisa experimental em laboratório do tipo quantitativa na determinação do número de unidades formadoras de colônias por mililitro (UFC/ml) da bactéria Enterococcus faecalis e na determinação do número de dias necessários para os extratos naturais e a clorexidina agirem como bactericidas ou não, frente as UFC/ml presentes nos tubos desafios.
Para a realização desse trabalho foram utilizados 12 tubos de ensaio os quais foram divididos em 6 grupos, com 2 tubos cada, a saber: grupo – placebo (água destilada estéril); grupo 2 – clorexidina 2% (grupo controle); grupo 3 – óleo essencial de Rosmarinus officinalis; grupo 4 – extrato glicólico de Própolis 2%; grupo 5 – extrato glicólico de Punica granatum 2% e grupo 6 – tubo de prova para acompanhamento de sobrevivência bacteriana. O grupo 6 foi constituído somente com o meio de cultura sem adição de placebo ou qualquer outro produto desafio em teste.
Os extratos naturais foram adquiridos em farmácia de manipulação acompanhados de certificado de análise emitido pelo fabricante contendo as concentrações de ativos. A cepa de Enterococcus faecalis foi isolada no laboratório de microbiologia da UNOESC e identificada por técnicas usuais para a espécie conforme descrito pela ANVISA (2004). Os tubos foram preparados conforme esquema ilustrado na Figura 1.
Figura 1 – Preparação dos tubos
Fonte: Anvisa (2014).
Cada tubo recebeu 1 mililitro (ml) do meio de cultura BHI, a seguir, foi realizada a inoculação dos tubos (1 a 6) com agulha de platina, contendo uma porção suficiente para que ocorresse a contaminação bacteriana. Após a inoculação das séries de tubos 1 e 2, estas foram incubadas em estufa bacteriológica em temperatura de 36,5oC (+/-1ºC) por 24 horas, temperatura e tempo
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de incubação considerados ideal para crescimento de bactérias mesófilas. Decorrido o tempo de incubação, o conteúdo dos tubos foi semeado em estrias longitudinais nas placas contendo o meio de cultura CHROMagar Difco® e devolvidos a estufa de cultura bacteriológica para incubação por 24 horas. Transcorridas as 24 horas, as placas foram retiradas para leitura com intuito de verificação do crescimento bacteriano, comprovando a contaminação (Figura 2).
Figura 2 – Placa semeada com o conteúdo dos tubos
Fonte: os autores.
Os tubos então receberam 1 ml de cada substância desafio e foram devolvidos à estufa bacteriológica e incubados por mais 24 horas. Decorrido o tempo de incubação o conteúdo dos tubos foi novamente semeado nas placas de Petry contendo o meio de cultura já citado e os tubos e placas foram reincubados em estufa bacteriológica por mais 24 horas.
Todo o processo foi repetido durante 10 dias, sendo que, os tubos contendo os ativos naturais que se mostraram negativos em qualquer um dos dias de acompanhamento, foram semeados em placas por apenas mais 2 dias consecutivos, para confirmar a negatividade e considerados como resultado efetivo de destruição das unidades formadoras de colônias bacterianas presentes. Todo o processo foi realizado em condições assépticas e em laboratório de microbiologia com o bico de Bunsen aceso.
3 RESULTADOS
Decorrido o tempo de incubação, os resultados mostraram que o tubo de ensaio contendo a suspensão bacteriana e colocado em desafio com o placebo (grupo 1) apresentou o resultado esperado, uma vez que possibilitou o isolamento do Enterococcus faecalis em todos os dias testados, este fato também ocorreu com o grupo 6, onde a suspensão bacteriana estava somente com o
Artigos 79 meio de cultura BHI, demonstrando que as bactérias se mantiveram vivas durante todo o período cronológico do teste (figura 3).
O tubo desafio contendo a solução de clorexidina 2% (grupo 2) inibiu o crescimento bacteriano a partir do primeiro dia de incubação, isso foi comprovado por meio da realização de cultura diária, em que após a semeadura da placa de Petry, em estria, e posterior incubação em estufa bacteriológica pelo tempo e temperatura considerados neste trabalho, não houve crescimento bacteriano, o que comprova não só a eficácia da solução da clorexidina 2% sobre a bactéria em teste, mas também seu efeito residual, mantendo sua ação bactericida durante os 10 dias testados (Figura 4).
Figura 3 – Placa semeada do 1º dia
Fonte: os autores.
Figura 4 – Placa semeada do 10º dia
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Os tubos desafio contendo os extratos naturais (grupo 3 – óleo essencial de Rosmarinus officinalis, grupo 4 – extrato glicólico de Própolis, grupo 5 – extrato glicólico de Punica granatum) mostraram crescimento bacteriano em todos os dias de repique para as placas contendo o meio de cultura selecionado, isto significou que não houve efeito bactericida, uma vez que o repique possibilitou o isolamento bacteriano após a semeadura das suspensões, durante os 10 dias do teste, como pode ser visto nas figuras 3 e 4.
4 DISCUSSÃO
O poder agressivo do Enterococcus faecalis está relacionado com a sua patogenicidade que é multifatorial, podendo ser relacionada à colonização, à competição com outra bactéria e à resistência aos mecanismos do hospedeiro, esses fatores o tornam capaz de estabelecer uma infecção endodôntica e manter uma resposta inflamatória potencialmente danosa ao hospedeiro (KAYAOGLU; ORSTAVIK, 2004). Ainda, no interior do canal radicular as bactérias encontram uma série de condições desfavoráveis, como a deficiência de nutrientes, a presença de toxinas e de outras bactérias e a medicação intracanal, porém o Enterococcus faecalis tem capacidade de se locomover, conseguindo penetrar profundamente nos túbulos dentinários, resistindo a medicação intracanal (PARADELLA; KOGA-ITO; JORGE, 2007). Devido a sua capacidade de invadir os túbulos dentinários, a resistência a medicação intracanal e a sua alta prevalência nos casos de insucesso do tratamento endodôntico o Enterococcus faecalis foi escolhido para ser utilizado nesta pesquisa.
Existem diversas opções de medicações intracanal sob diferentes apresentações: líquida, gel ou pasta (FERREIRA, 2010). Um exemplo é a clorexidina, muito utilizada como solução irrigadora nos tratamentos endodônticos, porém seu uso como medicação intracanal pode ser vantajoso, principalmente em casos de retratamento, onde se encontram bactérias mais resistentes. O potencial antibacteriano da clorexidina frente ao Enterococcus faecalis já foi comprovado em diversos estudos. Parsons et al. (1980) foram os primeiros pesquisadores que sugeriram a utilização da clorexidina no tratamento endodôntico, na pesquisa foi avaliado o poder antibacteriano, a adsorção e a liberação da solução de clorexidina em polpas bovinas e amostras de dentina contaminadas com Enterococcus faecalis. Os autores observaram que as amostras tratadas com clorexidina não apresentaram contaminação após 48 e 72 horas de exposição à bactéria.
Gomes et al. (2001) realizaram uma pesquisa semelhante ao nosso trabalho, misturaram 2 ml de suspensão bacteriana do Enterococcus faecalis com clorexidina, usada como solução irrigadora, em diferentes concentrações e diferentes espaços de tempo variando de segundos a horas. A análise microbiológica posterior mostrou que a ação irrigadora foi eficaz como antimicrobiano frente ao agente etiológico testado, posteriormente comprovado este fato por Vianna et al. (2005) em seu estudo que avaliou a ação antibacteriana da clorexidina gel e líquida nas mesmas concentrações usadas por Gomes et al. (2001), observando ainda que a clorexidina líquida 1% e 2% levaram o mesmo tempo para eliminar os microrganismos que o hipoclorito de sódio a 5,25%.
Artigos 81 O efeito residual da clorexidina também foi comprovado por Dametto et al. (2005) quando compararam in vitro a atividade antimicrobiana da clorexidina nas formas gel e líquida e do hipoclorito de sódio sob raízes de dentes contaminados por 7 dias com Enterococcus faecalis. Mesmo proporcionando redução microbiana imediatamente após o preparo dos corpos de prova, o hipoclorito de sódio, diferentemente da clorexidina em ambas as formas, não foi capaz de manter essa redução microbiana 7 dias após o preparo.
Todos os estudos acima citados (PARSONS et al., 1980; GOMES et al., 2001; VIANNA et al., 2005; DAMETTO et al., 2005) foram comprovados em nosso estudo o qual demonstrou o efeito bactericida da clorexidina a 2%, sendo que em 24 horas, o produto eliminou as unidades formadoras de colônias apresentando cultura negativa após semeadura e incubação, sendo as culturas mantidas negativas durante os dez dias de estudo, não havendo recolonização bacteriana.
Os resultados obtidos para o extrato de própolis mostraram a sua falta de ação sobre o Enterococcus faecalis, este fato nos permite questionar o emprego desta substância nas situações clínicas onde ocorre a viabilidade desse microrganismo. Porém diversos estudos como o de Onçaag et al. (2006), Molina (2008), Awawdeh et al. (2009) e Kandaswamy et al. (2010), demostraram resultados diferentes, com boa eficácia antimicrobiana da própolis frente ao Enterococcus faecalis. Entretanto, os estudos citados foram realizados, in vivo, em dentina infectada, não podendo então ser confrontados com esse trabalho devido a diferenças metodológicas.
Brito (2010), utilizou dentes humanos recém extraídos para avaliar a ação da clorexidina e de extratos naturais, dentre eles o extrato glicólico de própolis 12% e da Punica Granatum L, frente ao Enterococcus faecalis, após coleta de dados observou que a clorexidina e o própolis tiveram efeito bactericida frente ao microrganismo, inibindo seu crescimento durante os 7 dias do teste, já a Punica Granatum L, apesar de ter diminuído o crescimento bacteriano na primeira coleta, não conseguiu manter sua ação até o fim do estudo. Os resultados da própolis obtidos por Brito (2010) foram diferentes dos encontrados no presente estudo, isso pode ter ocorrido devido a concentração da suspensão utilizada. Já em relação a Punica Granatum L, os resultados foram semelhantes.
Koo et al. (2000), Maia Filho et al. (2008) e Siqueira et al. (2014) utilizaram a própolis em veículo hidroalcoólico para testar sua ação frente ao Enterococcus faecalis, também encontraram resultados diferentes dos resultados obtidos no presente estudo. A explicação para essa diferença pode ser relacionada ao veículo, pois o álcool possui atividade antibacteriana.
Inácio e Telles (2010), usaram a técnica de difusão em ágar para avaliar a atividade antimicrobiana da suspensão de própolis 5% e 10% em propilenoglicol, frente ao Enterococcus faecalis. Após coleta de dados os autores observaram que a suspensões de própolis não apresentaram halos de inibição contra o microrganismo, concordando com os resultados obtidos em nosso estudo.
No estudo de Ferreira Filho et al. (2015) o Rosmarinus officinalis teve seu resultado apresentando halos de inibição médios de 7 mm em concentração de ativos de 14,0625 mg/mL quando em teste desafio frente ao Enterococcus faecalis, concluindo que a sua tintura fitoterápica, apresentou fraca atividade contra a bactéria, o que corrobora com o presente estudo, no qual não apresentou eficácia frente ao Enterococcus faecalis.
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Petrolili et al. (2013) testaram o efeito bactericida do extrato das folhas do Rosmarinus officinalis extraídos em solvente hidroalcoólico, observaram os autores que este teve efeito bactericida sobre cepas de Enterococcus faecalis, o que foi corroborado por Oliveira (2016), que obtiveram resultados parecidos, porém este estudo não é comparável ao presente uma vez que os solventes usados foram outros.
Nimri, Meqdam e Alkofahi (1999) estudaram a ação do extrato hidroalcoólico obtido da casca da Punica granatum, os quais foram consideradas de amplo espectro no que se refere atividade antibacteriana, observaram os autores que as espécies bacterianas testadas, in vitro, foram inibidas quando colocadas em contato com o extrato, inclusive cepas do Enterococcus faecalis, entretanto por se tratar de extrato hidroalcoólico, o resultado foi divergente de nosso estudo.
Opara, Al-Ani, Al-Shuabi (2009) realizaram um estudo testando a bioatividade do arilo (excrescência, presente na superfície das sementes) da Punica granatum, ele constatou que este extrato possui capacidade de eliminar a atividade bacteriana do Enterococcus faecalis.
Foi realizado um estudo in vitro por Hajifattahi et al. (2016), onde o extrato de Punica granatum foi preparado utilizando pétalas em pó e solvente de água-etanol. Neste estudo o extrato hidroalcoólico de Punica granatum mostrou efeitos inibidores sobre o crescimento e proliferação de todas as cinco bactérias que foram testadas (S. mutans, S. sanguinis, S. salivarius, S. sobrinus, e E. faecalis), porém, o menor diâmetro da zona de inibição do crescimento foi da Enterococcus faecalis. Sendo assim a pesquisa de Hajifattahi et al., corrobora com o presente estudo.
5 CONCLUSÃO
Tendo em vista os resultados encontrados por meio da metodologia utilizada na presente pesquisa, constata-se que os extratos glicólicos da Própolis, da Punica granatum e o óleo essencial do Rosmarinus officinalis, nas concentrações utilizadas, não tem efeito bactericida frente a bactéria Enterococcus faecalis. Todavia, acredita-se que o estudo pode ser levado adiante, utilizando diferentes concentrações dos extratos. A Clorexidina 2% é um forte agente contra a bactéria, demonstrando sua eficácia já no dia 1.
REFERÊNCIAS
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