GRUPO (G1C/G2C) 4) Análise intergrupo:

Através do teste t-Student com variâncias iguais para a comparação entre os lados controles dos grupos 1 e 2, revelou-se que não houve diferença estatística quanto à expressão do GATA-3 (P  0,05) nos diferentes grupos, ou seja, houve uma pequena expressão deste marcador que não se alterou nos dois grupos controle (Gráfico 1).

Gráfico 1. Média de expressão do GATA-3 nos grupos 1 e 2, nos lados teste (com ligadura) e controle (sem ligadura).

As médias do GATA3 foram mais elevadas nas amostras do grupo experimental do que no grupo controle. Observa-se em um nível de significância de P  0,05 que houve diferença intragrupos e intergrupo somente entre os grupos testes. Não houve diferença entre os grupos controles.

6.4.2 - Análise quantitativa da subunidade IFN-R1: as médias do IFN-R1 foram correspondentemente mais elevadas nas amostras do grupo experimental do que no grupo controle com diferenças significantes ao nível de significância considerada em cada um dos grupos (p < 0,05); em cada um dos lados as médias foram correspondentemente mais elevadas no grupo 1 do que no grupo 2. Os resultados estão descritos na Tabela 10.

Tabela 10. Estatísticas da variável IFN-R1 segundo o grupo e o lado.

Grupo

Estatísticas _{Lado 1 2 Valor de p}

 Média Teste 138,98 102,11 p(3) = 0,077 Controle 66,25 61,44 p(4) = 0,661

Valor de p p(1) = 0,001* p(2) = 0,016*

 Mediana Teste 115,80 90,80 Controle 61,40 57,20  Desvio padrão Teste 69,71 71,50 Controle 21,85 35,39

(1): Através do teste t-Student pareado para a comparação intragrupo para cada um dos grupos.

(2): Através do teste de Wilcoxon com dados pareados para a comparação intragrupo em cada um dos grupos. (3): Através do teste de Mann-Whitney para a comparação entre grupos 1 e 2 em cada lado.

(4): Através do teste t-Student com variâncias iguais para a comparação entre os grupos 1 e 2 em cada lado.

GRUPO (G1C/G1T) 1) Análise intragrupo:

Através do teste t-Student pareado para a comparação entre os lados teste e controle do grupo 1, revelou-se que houve diferença estatisticamente significante na expressão do IFN-R1 (P  0,05) entre o lado teste e o lado controle, o que sugere a maior expressão deste receptor no grupo de maior intensidade de resposta inflamatória (grupo teste).

GRUPO (G2C/G2T) 2) Análise intragrupo:

Através do teste de Wilcoxon com dados pareados para a comparação entre os lados teste e controle, revelou-se que houve diferença estatisticamente significante na expressão do IFN-R1 (P  0,05) entre os lados, o que sugere a maior expressão deste receptor no grupo de maior intensidade de resposta inflamatória (grupo teste), conforme ilustrado pelo Gráfico 2.

GRUPO (G1T/G2T) 3) Análise intergrupo:

Através do teste de Mann-Whitney para a comparação entre os lados testes dos grupos 1 e 2, constatou-se que não houve diferença estatística quanto a expressão deste marcador (P  0,05) nos diferentes grupos, ou seja, o fator tempo na presença da ligadura, não foi determinante para que houvesse uma maior expressão do IFN-R1(Gráfico 2).

GRUPO (G1C/G2C) 4) Análise intergrupo:

Através do teste t-Student com variâncias iguais para a comparação entre os lados controles dos grupos 1 e 2, verificou-se que não houve diferença estatística quanto a expressão deste marcador (P  0,05) nos diferentes grupos, ou seja, a expressão do receptor foi similar entre os grupos controles (Gráfico 2).

Gráfico 2. Média da expressão do IFN- nos grupos 1 e 2 nos lados teste (com ligadura) e controle (sem ligadura).

As médias do IFN- (análise intragrupo) foram mais elevadas nas amostras do grupo teste do que no grupo controle considerando o valor de P  0,05. Na análise intergrupo, não houve significância estatística.

DISCUSSÃO

Atualmente, é completamente aceito que a doença periodontal resulta de uma resposta inflamatória do hospedeiro ao biofilme dental, sendo a natureza desta resposta determinante para o caráter destrutivo da doença. Com o aumento do desafio bacteriano, produtos nocivos ao hospedeiro interagem com o tecido gengival e induzem a expressão de várias moléculas efetoras, dentre as quais destacam-se as metaloproteinases (SEABRA, 2006) e as citocinas (GEMMELL, YAMAZAKI, SEYMOUR, 2002). As citocinas exibem um forte papel regulatório na resposta imune, possuindo como uma das principais funções, regular a diferenciação de células T virgens em células Th1 e Th2. Como exemplos podem ser citadas as citocinas Th1: IL-12 e IFN- envolvidas no desenvolvimento de células Th1 e a citocina Th2: IL-4 envolvida na diferenciação das células Th2 (MURPHY, REINER, 2002; O’GARRA, 1998) além de outras citocinas que estão diretamente envolvidas na patogênese da doença periodontal, como a interleucina -1 (IL-1) e o fator de necrose tumoral , que regulam positivamente a síntese de colagenases e prostaglandinas pelos fibroblastos e macrófagos, estando envolvidas direta e indiretamente no processo de reabsorção óssea visto na doença periodontal (ALEXANDER; DAMOULIS, 1994).

O efeito em rede das citocinas Th1 (IL-2, IFN- , IL-12) aumenta a resposta imune celular, enquanto que as citocinas Th2 (IL-4, IL-5, IL-13) suprimem a resposta imune celular e aumentam a resistência associada com a imunidade humoral, ou seja, as citocinas Th2 estão envolvidas na ativação das células B com conseqüente produção de anticorpos. Para Gemmell e Seymour (2004), as lesões periodontais em que predominam as células Th1 teriam um perfil de lesão estável (gengivite); já nas lesões onde predominam as células Th2, um perfil destrutivo (periodontite) estaria presente. Como o exato conhecimento desta resposta permanece ainda alvo de pesquisa, o presente estudo buscou observar, através de técnicas imuno-histoquímicas, a expressão das células Th2 na fase destrutiva da doença periodontal, comparando com um grupo controle, bem como avaliar possíveis diferenças na expressão do receptor de superfície IFN-R1, já que sua expressão é determinante para que haja uma efetiva resposta Th1, nos diferentes tempos de evolução da doença periodontal induzida em ratos, através de ligaduras.

Este modelo experimental de indução de periodontite em ratos, por meio da colocação de ligaduras de algodão na região cervical de molares inferiores tem sido amplamente

utilizado em pesquisas sobre a doença periodontal (CAVAGNI et al., 2005; GALVÃO et al., 2003; SALLAY et al., 1984).

Gurgel (2003) evidenciou que a presença das ligaduras na região cervical de molares de ratos é capaz de induzir perda óssea, em função de ocorrer uma rápida colonização bacteriana nas ligaduras, além do fato da posição mais apical em relação à margem gengival, produzir uma injúria traumática. Graves et al. (2008) acrescentam que a colocação de ligaduras ao redor dos dentes levam a um maior acúmulo de biofilme e ulceração do epitélio sulcular, o que facilita a invasão bacteriana ao tecido conjuntivo, levando a uma resposta do hospedeiro que culmina com a destruição do suporte periodontal. Estes relatos, ajudam a entender o porque, da presença de uma resposta inflamatória, de moderada a intensa, no presente estudo, já a partir do segundo dia de indução da doença periodontal, com o uso de ligaduras.

O papel funcional da resposta inflamatória em ratos, na destruição periodontal experimental, fica claro nos estudos que utilizam inibidores de prostaglandinas, ou seja, a inflamação gengival e a perda óssea podem ser diminuídas durante a administração de drogas anti-inflamatórias (GURGEL, 2003). Contudo, Cavagni et al. (2005) encontraram aumento de perda óssea alveolar na periodontite induzida por ligaduras, quando drogas esteroidais foram administradas, subcutaneamente, em ratos. Isto, portanto, demonstra que assim como em humanos, a fase destrutiva da periodontite experimental, nos modelos induzidos por ligadura, está associada com a resposta do hospedeiro e que os uso de drogas anti-inflamatórias podem alterar esta resposta.

No presente estudo, observamos nos grupos controles a presença discreta de um infiltrado celular tipicamente linfocitário, sendo a presença destas células, na ausência de ligaduras, um possível indicador da resposta constante ao desafio bacteriano presente no biofilme e sulco gengival, o que está de acordo com Galvão et al. (2003). Já nos grupos experimentais ocorreu uma resposta inflamatória celular aguda no periodonto destes ratos. Observou-se que com apenas 2 dias da presença da ligadura houve uma mudança na intensidade do infiltrado celular, deixando de ser discreto para tornar-se moderado a intenso, permanecendo assim, mesmo após 15 dias. Em relação ao tipo de infiltrado, nos grupos testes, linfócitos e plasmócitos predominaram, enquanto que nos grupos controles os linfócitos foram as células predominantes, sendo observada a presença freqüente de neutrófilos em toda a amostra teste.

Como descrito na literatura, com a contínua agressão ao periodonto, o perfil linfocitário predominante parece mudar quando uma lesão gengival precoce evolui para uma

lesão gengival estabelecida ou avançada. Seymour em 1991 já afirmava que na gengivite, poucas células B se faziam presentes e que as lesões progressivas exibiam proporções aumentadas de células B, levando a crer que o plasmócito predominava nestas lesões. Para Berglund, Donati e Zitzmann (2007) é evidente que os linfócitos B e plasmócitos predominam entre as células presentes na periodontite. Contrariamente, no estudo de Lins et al. (2008), não foi encontrada diferença na densidade de linfócitos T e B entre lesões de gengivite e periodontite crônica, contudo, houve um leve predomínio de células B nas lesões de gengivite, o que levou os autores a afirmarem que estas lesões de gengivite, provavelmente, já eram lesões estabelecidas e não incipientes, ou seja, estavam em um estágio mais avançado da resposta inflamatória. Para Yamazaki, Nakagima, Hara (1995) a maior participação das células B nas lesões avançadas, implica na maior participação das células Th2, pois citocinas Th2 como IL-4, IL-5, IL-6 estimulam a proliferação e diferenciação da célula B (ABBAS, LICHTMAN, PILLAI, 2008, GEMMEL et al., 2002a).

Os resultados, do presente estudo, mostraram a participação das células Th2 nos grupos testes, ou seja, na fase de maior resposta inflamatória vista na doença periodontal experimental. Uma resposta inflamatória mais intensa levou a um processo destrutivo, que ficou evidente nos estágios mais avançados da doença, principalmente no grupo G2T, onde todos os espécimes exibiram algum grau de reabsorção; contudo, no grupo G1T, em 4 casos, observamos focos iniciais de reabsorção óssea, indicando que neste modelo de doença experimental o processo inflamatório instala-se rapidamente, com conseqüente destruição do tecido periodontal, isto, provavelmente, torna este modelo ideal para o estudo da fase aguda da doença periodontal, o que está de acordo com Nyman, Schroeder, Lindhe (1979) que descrevem a presença da ligadura ao redor de molares e pré-molares como indutoras de uma resposta inflamatória aguda, resultando em perda de inserção de tecido conjuntivo e osso alveolar.

Para o estudo das células Th2, utilizamos um marcador imuno-histoquímico para o fator de transcrição específico da célula Th2: GATA-3. A expressão do GATA-3 é induzida rapidamente, pela IL-4, nas células comprometidas Th2 (MURPHY, REINER, 2002). A primeira função descrita do GATA-3 no sistema imune foi a de ser um fator de transcrição específico da célula Th2 e parece estar envolvido em vários passos da diferenciação das células T no timo e nos órgãos linfóides periféricos (HO, PAI, 2007). Portanto, espera-se haver um aumento na expressão deste marcador quando células Th2 estão presentes no meio.

A perda óssea, que se traduz no maior sinal de destruição tecidual, neste modelo de doença experimental em ratos, parece se estabilizar com o decorrer do tempo (GURGEL et

al., 2003, KURH et al., 2004). Segundo Graves et al. (2003), previsivelmente, a perda ocorre em um período de 7 dias. No presente estudo, a perda óssea foi observada no período de 2 a 15 dias, nos grupos testes, sendo mais evidente ao final de 15 dias em 100% da amostra. A presença da perda óssea foi compatível com o aumento de expressão do marcador GATA-3 quando comparados os grupos controles e experimentais, sendo o uso das ligaduras determinante para que um processo inflamatório se instalasse com consequente destruição óssea e maior envolvimento das células Th2 na fase destrutiva da doença periodontal. Já quando se comparou somente os grupos experimentais, observou-se que a expressão do GATA-3 reduziu significativamente (P  0,05), ou seja, com o passar do tempo evidenciou-se uma redução na quantidade de células Th2 (G1T = 149,27/G2T = 89,84). Com esta redução, as propriedades anti-inflamatórias da resposta Th2, provavelmente, são reduzidas. Okamatsu et al. (2004) associaram a ausência da IL-10 (menor resposta Th2) com presença severa de perda óssea induzida pelo patógeno P. gingivalis, o que levou estes autores a descreverem a resposta Th2 como protetora. Eles ainda descrevem como características protetoras destas células, o fornecimento de sinais que culmina na produção de anticorpos específicos que pode resultar no controle da infecção periodontal. Portanto, com a diminuição da expressão do GATA-3, seu potencial anti-inflamatório é também reduzido o que culmina com a maior perda óssea vista no grupo G2T. Como este modelo tende a estabilizar-se com o tempo, pode ser que estudos envolvendo um maior período de observação resultem no retorno da expressão deste marcador.

Como houve uma diminuição do GATA-3 na fase mais avançada da doença, cabe uma investigação se isto ocorreu devido a uma maior resposta Th1, pois um tipo de resposta parece suprimir a outra (GEMMEL et al., 2002a). Pensando nisso, tentou-se observar através da expressão da subunidade IFN-R1 do receptor para IFN-, se o microambiente encontrava-se preparado para a ação desta principal citocina Th1, uma vez que a presença de receptores funcionais sobre as células para o IFN- poderia estar associada com a presença da citocina no meio extracelular (MURPHY, REINER, 2002) e a partir disto tentar estabelecer possível relação entre a presença do receptor com a presença da citocina Th1 no meio extracelular.

O IFN- consiste na principal citocina Th1 (ABBAS, LICHTMAN, PILLAI, 2008; TENG, 2003). Para que esta citocina exerça suas funções biológicas, ela deve ligar-se ao seu receptor na superfície da célula. Quando esta ligação ocorre, fatores de transcrição e ativação (STAT1) são ativados, levando a expressão do fator de transcrição T-bet, nestas células. A expressão do T-bet leva a um remodelamento do gene IFN- tornando-o ativado, o que induz

a expressão da subunidade β do receptor da IL-12 nas células Th1. A sinalização através do receptor da IL-12 culmina com a produção direta ou indireta de mais IFN-, o que amplifica a resposta Th1. Além disto, o IFN- promove a ativação de macrófagos, que são produtores de IL-12 (TENG, 2003). Isto demonstra as principais ações desta citocina e de como ela está diretamente relacionada com a resposta Th1.

Quando analisou-se a expressão desta subunidade IFNR1, entre os grupos testes e controles, houve uma expressão estatisticamente significante, demonstrando uma maior expressão desta subunidade na fase ativa da doença periodontal. Já quando analisamos inter- grupo, ou seja, entre os grupos experimentais ou controles, a expressão deste receptor não se alterou. Estas informações revelam que houve uma relação direta entre o aumento da resposta inflamatória e a expressão do IFN-R1. Este resultado está de acordo com o estudo de Ukai et al. (2001) que demonstrou que células transportando IFN- aumentaram significativamente com o aumento da resposta inflamatória e associaram sua expressão com a destruição tecidual vista na periodontite; contudo, no presente estudo, a expressão do IFN-R1 não se alterou com o aumento da perda óssea, o que demonstra que com a progressão da doença periodontal a expressão deste receptor se manteve inalterada. Isto pode ser explicado, baseado nos tipos celulares que expressam este receptor. O IFN- exerce sua função em muitas células inflamatórias, como os macrófagos, células NK, linfócitos T, linfócitos B (ABBAS, LICHTMAN, PILLAI, 2008); portanto, é esperado que com o aumento da resposta inflamatória, este receptor esteja marcadamente mais expresso.

As principais células envolvidas com a resposta ao IFN- são as células Th1. Estas células, bem como as células Th2 são portadoras do receptor para IFN-. As células Th2 possuem as duas subunidades deste receptor, a subunidade IFN-R1 e IFN-R2, já as células Th1 parecem não exibir a subunidade IFN-R2 deste receptor. A ausência desta subunidade está relacionada a uma ausência de resposta ao IFN- pelas células Th1 comprometidas, e isto pode ser de fundamental importância para o desenvolvimento de uma função efetora Th1 normal (TAU et al., 2000). Portanto, nas células Th1, a subunidade que parece ser submetida a mecanismos regulatórios é a subunidade R2 e não a R1.

Para Bach, Aguet, Schreiber (1997) a subunidade IFN-R1 do receptor IFN-R, não é exclusiva das células Th, ela é moderadamente expressa em quase todas as células inflamatórias ou não e a expressão do gene para a cadeia R1 parece ser constitutiva, nestes tipos celulares. A análise da região promotora deste gene revelou uma estrutura que lembra genes “housekeeping” (genes envolvidos nas funções básicas da célula e que são

constitutivamente expressos). Estes autores afirmam, ainda, que a expressão desta subunidade do receptor para IFN- não é regulada por estímulos externos, ao contrário da subunidade R2, que pode ser regulada positivamente ou negativamente dependendo do estímulo.

Analisando estas informações, percebe-se que a subunidade R1, do receptor para IFN- , não é um bom indicador de resposta Th1, pois esta subunidade não sofre mecanismos regulatórios associados à presença da citocina no meio, sendo descrita como uma subunidade constitutivamente expressa, inclusive, em vários outros tipos celulares. Portanto, só podemos inferir, no presente estudo, que o aumento da resposta inflamatória foi associado com o aumento de sua expressão, tornando estes microambientes preparados para a resposta Th1.

Resume-se a importância desta subunidade, para a resposta Th1, na fase de comprometimento da célula T CD4+, pois a sua presença faz com que o IFN- se ligue e promova a diferenciação destas células em células Th1 (MURPHY, REINER, 2002). Mecanismos regulatórios, da subunidade R1, foi descrito por Skarenta et al. (2000) que descreveram uma regulação negativa, de forma transitória, nas células T virgens, logo após reconhecimento antigênico. Sem esta subunidade não ocorre à ligação com a citocina e efeitos antiproliferativos associados ao IFN- seriam anulados. Isto, talvez explique a leve redução da expressão desta subunidade no grupo G2T, na presente pesquisa.

De acordo com os resultados observados, no presente estudo, em relação ao infiltrado inflamatório, podemos confirmar que a resposta inflamatória nos diferentes tempos de indução da doença (G1T e G2T) permaneceu de moderada a intensa, demonstrando que neste modelo, as ligaduras foram capazes de provocar resposta inflamatória, mas o número total de células se manteve, em níveis semelhantes, com a evolução da doença. Resultados similares, já descritos acima, foram observados por LINS et al. (2008) quando analisaram o fenótipo imuno-histoquímico das células que participam da resposta imune na gengivite e periodontite crônica. Observaram não haver diferença significativa em relação à densidade dos linfócitos T e B, bem como no número de células dendríticas, nas condições inflamatórias descritas. A manutenção no número de células, provavelmente explica a expressão continuada da subunidade R1 do receptor para IFN-, nos diferentes tempos de evolução da doença periodontal.

Não há dúvida quanto à participação aumentada da célula Th2 na periodontite, o que foi confirmado no presente estudo quando comparados os grupos controle e experimental. Contudo, não se sabe com certeza se estas células são mais protetoras ou destrutivas dentro do contexto da patogênese periodontal, pois elas exibem papéis conflitantes, ou seja, ora podem

ser destrutivas ora protetoras de acordo com o seu perfil de expressão. Um exemplo, de seu papel protetor se dá por suas propriedades supressoras/anti-inflamatórias, já descritas acima. Gemmell, Yamazaki e Seymour (2002) acrescentam que as células Th2 podem silenciar a atividade de algumas citocinas pró-inflamatórias como a IL-1 e um exemplo de seu papel destrutivo é que, devido ao seu potencial anti-inflamatório, elas podem reduzir a resposta Th1, o que resultaria na falha do controle da infecção (LAPPIN et al., 2001).

Por sua vez, a resposta Th1 culmina com a produção do IFN-, citocina esta que tem propriedades ativadoras sobre os macrófagos e neutrófilos, aumentando a capacidade fagocitária destas células o que leva à eliminação de patógenos invasores, possuindo, portanto um papel de proteção ao hospedeiro (GEMMELL, YAMAZAKI, SEYMOUR, 2002). Sasaki et al. (2003) também sugerem um papel protetor da resposta Th1 ao demonstrarem que esta resposta não teve um efeito significante na patogênese da reabsorção óssea estimulada por infecção.

Outros autores como Taubman e Kawai (2001) já consideram o potencial destrutivo da resposta Th1, relatando que a reabsorção óssea vista na doença periodontal é dependente do grau de recrutamento de células Th1 dentro dos tecidos gengivais inflamados, já que estas células regulam positivamente a produção de citocinas pró-inflamatórias IL-1 e TNF – α, que estão envolvidas em promover a diferenciação de precursores osteoclásticos e subsequentemente ativá-los. Adicionalmente, elas estão mais expressas quando destruição óssea alveolar significante foi detectada, sugerindo a participação destas citocinas no início da destruição óssea alveolar, enquanto que as citocinas Th2 poderiam estar envolvidas na proteção e reparo do tecido perdido (TENG, 2003).

Muitos trabalhos citam a participação combinada das citocinas Th1 e Th2 na doença periodontal. Como descrito por Alayan et al. (2007), estes dois grandes grupos de citocinas