Grupos e protocolos experimentais

O presente trabalho foi realizado em 4 etapas, sendo que, em cada uma delas, o protocolo experimental durou 28 dias e foi dividido em 2 períodos: (1) período de indução da hiperalgesia, correspondente aos 14 primeiros dias nos quais os animais receberam as injeções de PGE2, ou seu veículo, e (2) período de

manutenção da hiperalgesia, correspondente aos 14 dias subsequentes, após o término do tratamento com PGE2.

Foram realizados 14 grupos experimentais, constituídos da seguinte forma, ao longo das etapas do trabalho:

Etapa 1:

 grupo PGE2:animais que receberam injeções diárias de PGE2 na pata,

durante 14 dias (n=9);

 grupo Salina (estabelecido como controle): animais que receberam injeções do veículo da PGE2 (NaCl) (n=9);

Etapa 2:

 grupo PGE2 + SCL: animais que receberam PGE2, na pata enquanto

 grupo Salina + SCL: animais que receberam salina na pata enquanto foram submetidos ao protocolo de estresse crônico leve (n=9);

 grupo PGE2: animais que receberam PGE2 na pata, mas não foram

submetidos ao protocolo de estresse crônico leve (n=6);

 grupo Salina: animais que receberam salina na pata, mas não foram submetidos ao protocolo de estresse crônico leve(n=6);

Etapa 3:

 grupo PGE2 + K252a: animais que receberam PGE2 na pata e K252a no

NAc (n= 8);

 grupo PGE2 + Veículo: animais que receberam PGE2 na pata e o

veículo do K252a no NAc (n=8);

 grupo Salina + K252a: animais que receberam salina na pata e o K252a no NAc (n=8);

 grupo Salina + Veículo: animais que receberam salina na pata e o veículo do K252a no NAc (n=6);

Etapa 4:

 grupo PGE2 + DHF: animais que receberam PGE2 na pata e DHF no

NAc (n=6);

 grupo Salina + DHF: animais que receberam salina na pata e DHF no NAc (n=6);

 grupo PGE2 + Veículo: animais que receberam PGE2 na pata e o

veículo do DHF no NAc (n=6);

 grupo Salina + Veículo: animais que receberam salina na pata e o veículo do DHF no NAc (n=6).

No decorrer do trabalho, as etapas foram desenvolvidas conforme descrito abaixo:

 Etapa 1 - Para comprovar a efetiva reprodução do modelo de hiperalgesia persistente pelo tratamento crônico com PGE2, e avaliar

se a hiperalgesia induziu comportamento depressivo nos animais, foram realizadas as avaliações do limiar nociceptivo mecânico (teste de Randall-Selitto) e/ou do comportamento tido como depressivo dos animais (testes de Preferência por Sacarose e de Nado Forçado) nos dias 1, 7, 14, 21 e 28 do protocolo experimental (Figura 1). Os ratos

foram aleatoriamente divididos em 2 grupos experimentais: (1) grupo PGE2 e grupo Salina.

Figura 1: Esquema do delineamento experimental da 1ª etapa do trabalho. Indução da hiperalgesia persistente e avaliação do comportamento do tipo depressivo.

 Etapa 2 - Para verificar se o modelo de hiperalgesia persistente, associado a um segundo fator perturbador, foi capaz de gerar comportamento depressivonos animais, eles foram submetidos, simultaneamente, ao tratamento com PGE2 na pata e à um protocolo

de Estresse Crônico Leve (SCL) e divididos em 4 grupos experimentais: (1) grupo PGE2 + SCL,(2)grupoSalina + SCL, (3) grupo

PGE2 e (4) grupo Salina. Os testes de Randall-Selitto, para avaliação

do limiar nociceptivo mecânico, e/ou de nado forçado, para avaliação do comportamento tido como depressivo, foram realizados nos dias 1, 7, 14, 21 e 28 do protocolo experimetal (Figura 2).

Figura 2: Esquema do delineamento experimental da 2ª etapa do trabalho. Associação do modelo de indução da hiperalgesia persistente com o protocolo de estresse crônico leve.

 Etapa 3 - Para verificar se a resposta hiperalgésica seria ou não mediada pelo BDNF do NAc, através da ativação de receptor TrkB, durante os 7 primeiros dias do período de indução da hiperalgesia, foi administrado K252a (inibidor do receptor TrkB) intra-NAc. Imediatamente após ao teste nociceptivo, e à aplicação periférica da primeira dose de PGE2, ou salina, foi realizada a cirurgia estereotáxica

para implantação de cânulas guias e minibombas osmóticas nos animais para administração da droga no NAc. As avaliações do limiar nociceptivo mecânico foram realizadas nos dias 1, 7, 14, 21 e 28 do protocolo experimetal (Figura 3). Os animais foram divididos em 4 grupos experimentais: (1) grupo PGE2 + K252a, (2) grupo PGE2 +

Veículo, (3) grupo Salina + K252a e (4) grupo Salina + Veículo.

Figura 3: Esquema do delineamento experimental da 3ª etapa do trabalho. Bloqueio do receptor TrkB durante a indução da hiperalgesia persistente.

 Etapa 4: Para verificar se a ativação dos receptores TrKB anteciparia a instalação da hiperalgessia, foi administrado intra-NAc 7,8 Dihidroxiflavona Hidatado (DHF), um agonista seletivo de TrkB, ou seu veículo, durante os 7 primeiros dias de indução da hiperalgesia. Imediatamente após ao teste nociceptivo, e à aplicação periférica da primeira dose de PGE2, ou salina, os ratos foram canulados e divididos

em 4 grupos experimentais: (1) grupo PGE2 + DHF, (2) grupo Salina +

DHF, (3) grupo PGE2 + Veículo e (4) grupo Salina + Veículo. O limiar

nociceptivo mecânico dos animais foi avaliado nos dias 1, 5, 7, 14, 21 e 28 do protocolo experimental (Figura 4).

Figura 4: Esquema do delineamento experimental da 4ª etapa do trabalho. Ativação do receptor TrkB durante a indução da hiperalgesia persistente.

3.3 Modelo de indução da hiperalgesia persistente

Para a indução da hiperalgesia persistente, dose diária de Prostaglandina E2 (100ng/50µl/pata), ou salina (50µl/pata), foi administrada no tecido subcutâneo da

superfície dorsal da pata traseira direita do rato, durante 14 dias consecutivos. Dados da literatura comprovam que a administração subcutânea de Prostaglandina E2 (PGE2) por 2 semanas induz uma hiperalgesia mecânica que persiste por cerca

de 30 dias, após a interrupção do tratamento (Ferreira et al., 1990).

A dose de PGE2 utilizada no presente trabalho corresponde a uma dose

submáxima previamente estabelecida, obtida de uma curva dose-resposta (Ferreira et al., 1978). A administração da droga foi realizada com seringa de insulina (BD Ultra Fine 30U, agulha 29G).

Os 14 dias nos quais os animais receberam as injeções de PGE2 na pata

correspondeu ao período do protocolo experimental de indução da hiperalgesia persistente, e os 14 dias subsequentes, após o término do tratamento com PGE2, ao

período de manutenção.

3.4 Avaliação do limiar nociceptivo mecânico

O limiar nociceptivo mecânico dos animais foi quantificado pelo teste de Randall-Selitto (Randall and Sellito, 1957), utilizando um analgesímetro (Ugo Basile, Itália) que aplica uma pressão sobre a pata do animal, que aumenta linearmente ao longo do tempo.