Um fio de algodão foi aposto à borda mesenterial de todo o intestino delgado, sendo, posteriormente, medido por fita métrica, para se ob
sido semelhantes entres os Grupos I e II (Tabela 6).
Comprim xperimentação. 1 92 94 2 85,5 91 3 78,5 86,5 4 96 93,5 9 9 10 81,5 82 Média 90,15 90,20 5 3,5 89 6 8,5 96,5 7 82 83 8 97 89 9 97 97,5
Animal Grupo I (12 horas) Grupo II (24 horas)
Desvio padrão 7,53 5,31
Teste t Student para amostras independentes
ertencem aos Grupos Ia e IIa, respectivamente. Os acondicionados por 12 horas ou 24 horas na câmara hiperbárica refrigerada pertencem aos Grupos Ib e IIb, respectivamente.
tcalculado = - 0,017 p = 0,987 (N.S.)
Então, foi coletada uma porção de 6 cm do intestino delgado, por secção transversal do mesmo com bisturi, estando o ponto médio dessa porção eqüidistante da extremidade proximal e distal da peça cirúrgica. Esse segmento de jejuno de 6 cm foi dividido em dois outros de 3 cm (Figura 5). Cada segmento de 3 cm, após ser pesado em balança de precisão, foi colocado em um bécher de 50 mL contendo 40 mL de RLg. Os pesos de cada um destes segmentos foram semelhantes entre os diversos grupos (Tabela 7). Aleatoriamente, um dos frascos foi encaminhado para acondicionamento na geladeira e o outro, acondicionado na câmara hiperbárica refrigerada. Como descrito anteriormente, os segmentos de 3 cm acondicionados na geladeira por 12 horas ou 24 horas p
Figura 5 – intestino delgado (ID) a ser preservado.”y”= ponto médio do segmento.
Tabela 7 –
a hiperbárica refrigerada, por 12 ou por 24 horas, anteriormente à preservação.
RUPO
Animal Grupo Ia Grupo Ib Grupo IIa Grupo IIb Figura representativa da coleta do segmento de
Comparação dos pesos (g) dos segmentos de intestino destinados ao acondicionamento na geladeira ou na câmar
G S 1 0,77 0,75 0,72 0,70 2 0,81 0,83 0,82 0,84 3 0,82 0,80 0,77 0,78 4 0,80 0,82 0,84 0,86 5 0,85 0,84 0,81 0,83 6 0,86 0,88 0,84 0,86 7 0,87 0,84 0,80 0,79 8 0,84 0,83 0,86 0,85 9 0,85 0,87 0,87 0,88 10 0,77 0,75 0,79 0,80 Média 0,824 0,821 0,812 0,819 Desvio padrão 0,035 0,043 0,044 0,053
Teste t Student para
Grupo Ia x Grupo Ib Grupo IIa x Grupo IIb p = 0,656 (N.S.) p = 0,173 (N.S.)
amostras dependentes tcalculado = 0,461 tcalculado = - 1,481
Acondicionamento em geladeira
Os segmentos de jejuno pertencentes aos Grupos Ia ou IIa foram transportados, individualmente, dentro do bécher com RLg, acondicionados em caixa de isopor contendo água e gelo. Os frascos foram retirados da caixa e colocados em uma geladeira General Icy GE-02®, calibrada e mantida a uma temperatura entre 2 e 4 ºC.
Os segmentos de jejuno pertencentes ao Grupo Ia permaneceram na geladeira por 12 horas. Os segmentos de jejuno pertencentes ao Grupo IIa permaneceram na geladeira por 24 horas.
Acondicionamento na câmara hiperbárica refrigerada
Os segmentos de jejuno pertencentes aos Grupos Ib ou IIb foram imediatamente acondicionados em câmara hiperbárica refrigerada desenvolvida na Engenharia Industrial Mecânica da Universidade Santa Cecília38.
O dispositivo é constituído de um chassi de aço inoxidável (40 cm de largura, 28 cm de altura e 23 cm de profundidade) em que se apóiam um vaso de pressão e um sistema de refrigeração (Figura 6). O vaso de pressão tem um volume interno de 0,5 L. Há um espaço de 1,8 cm entre as paredes interna e externa do vaso de pressão, o qual se estabeleceu ao se colocar um cilindro de aço inoxidável de 3 mm de espessura, 7,8 cm de diâmetro interno e 12 cm de altura dentro de outro semelhante, porém com de 12 cm de diâmetro interno (Figura 7). Uma placa circular do mesmo material está soldada às bases dos cilindros, fechando-os inferiormente. Outra placa circular serve de tampo superior. Ela contém um furo por onde passa um sensor de temperatura e outros quatro furos por onde passam parafusos que estão fixados no vaso de pressão. Porcas de aperto, que são recartilhadas, propiciam o torque fácil com os parafusos, permitindo-se rápido fechamento e abertura do vaso de pressão (Figura 8).
Figura 6 – Foto da câmara hiperbárica refrigerada com sensor de temperatura no vaso de pressão (*), controlador computadorizado de temperatura (+) e conexão com a fonte de oxigênio (O).
Figura representativa do vaso de pressão e do sistema de refrigeração (compressor, conden
Figura 7 – sador,
expansor e serpentina) da câmara hiperbárica refrigerada. “
”= sentido do fluxo do fluído.Figura 8 – (T) no vaso de
pressão (V) e foto representativa da abertura da câmara hiperbárica refrigerada (N). Fotos do sensor de temperatura (*), das porcas recartilhadas (P), do tampo superior
Obtém-se a pressão desejada no interior do vaso de pressão ao se infundir oxigênio medicinal a 100% através de uma conexão lateral entre o vaso (Figura 6) e um cilindro de oxigênio de 1,5 L da White-Martins®. Essa pressão é monitorada por um manômetro de pressão da Eurosaff®. A pressão interna estabelecida no vaso da câmara para acondicionamento dos segmentos de intestino pertencentes aos Grupos Ib e IIb foi de 6,5 ATA (Figura 9), num ritmo de 3 ATA por minuto.
Figura 9 – Foto do cilindro de oxigênio (∗) acoplado ao manômetro de pressão (¨).
O sistema de refrigeração é constituído de um compressor de ar, um condensador, uma área de expansão do ar e uma serpentina. A serpentina está posicionada no espaço existente entre os cilindros que formam o vaso de pressão (Figura 7). Obtém-se a temperatura desejada no interior da câmara por meio de um controlador de temperatura computadorizado Presys® modelo DNY2030 que aciona e desliga o compressor a temperaturas pré-determinadas, aferidas no interior da câmara por um sensor calibrado Termopar-PT100® (Figura 6).
Para receber os segmentos de intestino delgado pertencentes aos Grupos Ib e IIb, a câmara foi previamente resfriada e mantida a uma temperatura entre 2 e 4 ºC. Para tanto, o controlador Presys® foi programado para ligar o compressor quando a temperatura no interior da câmara fosse igual a 3,6 ºC e desligá-lo a uma temperatura de 3,3 ºC, estabelecendo-se os ciclos de “liga-desliga” do compressor no experimento.
Uma folha de alumínio foi aposta às paredes internas do vaso de pressão para facilitar o fluxo de calor entre a serpentina e o órgão a ser preservado. Os bécheres contendo os segmentos de intestino foram colocados sobre essa folha de alumínio (Figuras 10 e 11) e a câmara foi fechada.
Figura 10 - Foto do interior do vaso de pressão (Ò) onde se apóia a folha de alumínio.
Foto do bécher contendo RLg e o segmento
Figura 11 - de jejuno ( ), apoiado em folha de alumínio ( ) que
reveste parte do interior do vaso de pressão.
Os segmentos de intestino pertencentes ao Grupo Ib permaneceram na câmara hiperbárica refrigerada por 12 horas. Os segmentos de intestino pertencentes ao Grupo IIb permaneceram na câmara hiperbárica refrigerada por 24 horas.
Monitoramento da temperatura
A temperatura ambiente do laboratório em que se realizaram os procedimentos foi mantida, por meio refrigerador de ar, entre 19 e 22 ºC. O monitoramento dessa temperatura foi feito por um termohigrômetro digital Alla France .
A monitoração da temperatura da RLg, utilizado para a lavagem do lúmen intestinal e
para a perfusão vascular, foi dada por um termômetro de mercúrio colocado em um bécher contendo uma amostra da RLg.
A temperatura da geladeira foi monitorada por um termômetro interno e um sensor externo, remoto e sem fio RadioSack .
®
®
A temperatura da câmara foi monitorada por um sensor calibrado de temperatura TERMOPAR-PT100®, cuja ponta esteve posicionada dentro do bécher de 50 mL que continha os 40 mL da RLg e o segmento de 3 cm do intestino (Figuras 8 e 11).
Protocolo 1
Os procedimentos de coleta e preservação dos segmentos intestinais de cada animal de experimentação foram anotados em ficha padronizada denominada Protocolo 1 (Figura 12).
PROTOCOLO 1
Observações:
Animal no Sexo Idade Peso Grupo Data
Início Término
Temperatura ambiente oC oC
Anestesia Início Término
Intercorrências
Operação Início Término
Intercorrências
Início Término Irrigação do lúmen intestinal
Temperatura RL Temperatura RL
oC oC
Volume utilizado de RL
mL
Intercorrências
Aorta Veia Mesentérica
Horário de ligadura dos vasos
Início Término Perfusão vascular Temperatura RL Temperatura RL o C oC Volume utilizado de RL mL Intercorrências Intestino Comprimento cm
Peso do segmento de intestino a ser preservado Destinado para a câmara hiperbárica Destinado para a geladeira
g g
Início Término Compressão da câmara
Início Término Descompressão da câmara
Figura12– Cópia da ficha padronizada para as anotações do procedimento de coleta e preservação do segmento intestinal de cada animal de experimentação.
Processamento histológico
Após o período de preservação, procedeu-se à descompressão da câmara, num ritmo de 1 ATA por minuto, para que ela pudesse ser aberta, e o intestino foi encaminhado para o processamento histológico.
Assim, cada segmento de jejuno de 3 cm foi dividido, por incisão a bisturi, em 3 partes iguais de 1 cm. O terço médio foi imediatamente mergulhado em solução de formaldeído a 10%, tamponado, para análise histológica, desprezando-se os segmentos laterais (Figura 13).
Figura 13 – Figura representativa do procedimento de coleta do fragmento de jejuno a ser processado para análise histológica.
Após a fixação por 12 horas, o material foi submetido a métodos para inclusão em parafina. Dos blocos foram obtidos cortes transversais (7 µm de espessura) do segmento intestinal.
Alguns cortes histológicos foram corados pela hematoxilina-eosina (H.E.) e analisados em microscópio de luz, por observador que desconhecia a distribuição amostral.
Graus de lesão da mucosa
Os achados microscópicos foram descritos e anotados e as lesões da mucosa intestinal foram graduadas, segundo os critérios de Chiu/Park39-41(Quadro 1).
Grau 0 Mucosa normal.
Grau 1 Espaço subepitelial no ápice da vilosidade.
Grau 2 Extensão do espaço subepitelial com moderado levantamento da camada epitelial com relação à lâmina própria.
Grau 3 Levantamento epitelial extenso do ápice à base da vilosidade com algumas vilosidades desnudadas.
Grau 4 Vilosidade desnudada com exposição de lâmina própria, capilares dilatados, aumento de celularidade da lâmina própria.
Grau 5 Desintegração da lâmina própria, hemorragia e ulceração. Grau 6 Lesão nas criptas.
Grau 7 Infarto transmucoso. Grau 8 Infarto transmural.
Quadro 1 – Critérios de graduação da lesão tecidual intestinal, ao microscópio de luz.
Histometria das vilosidades
Para se avaliar a altura das vilosidades, foi usado um sistema digital de captura de imagem Software Image plus, que trabalha em ambiente Windows e que consiste de um
microscópio Olympus BX51 com objetivas planocromáticas, acoplado a uma câmara de vídeo Oly 200 Olympus América Inc e um microcomputador Pentium Intel com 128 megabytes de memória RAM (random access memory = memória de acesso aleatório), com placa digitalizadora de imagens. Foram escolhidas aleatoriamente 10 vilosidades em cada lâmina e a medida da altura de cada uma se deu em aumento de 40 vezes. Por meio de programa de tratamento de imagens computadorizadas, Software Image tool, traçou-se uma linha reta que une duas linhas paralelas imaginárias, tangentes às bases e às extremidades livres de cada vilosidade voltadas para o lúmen intestinal. A medida dessa linha foi considerada a altura da vilosidade. Foi aferida em pixel (picture plus element = elemento por imagem) e, posteriormente, transformada para micrômetros (µm) na razão de um pixel equivalendo a 0,35µm.
Protocolo 2
Os achados microscópicos de graus de lesão da mucosa e morfometria das vilosidades de cada segmento de intestino foram anotados em ficha padronizada denominada Protocolo 2 (Figura 14).
PROTOCOLO 2
GRAU DE LESÃO x MÉTODO PRESERVAÇÃO
Segmentos intestinais Ia Ib IIa IIb
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
ALTURA VILOSIDADES (µm) x MÉTODO DE PRESERVAÇÃO
Ia Ib IIa IIb .1 .2 .3 .4 .5 .6 .7 .8 .9 .10
Observações: = número do segmento de intestino analisado (01 a 10). Analisadas 10 vilosidades por segmento (.1 a .10)
Figura14 – Cópia da ficha padronizada para as anotações das observações histológicas do grau de lesão e morfometria das vilosidades dos segmentos intestinais de cada animal de experimentação.
Índice de apoptose
Outros cortes foram coletados em lâminas silanizadas e processadas para reação imunoistoquímica.
A análise do índice de apoptose, por imunoistoquímica, foi feita pelo método de TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase deoxyuridine triphosphate nick-end
labeling)42. Os fragmentos, contracorados por hematoxilina, foram observados em microscópio de luz. A apoptose foi observada e avaliada nas criptas e vilosidades intestinais. Considerou-se como um evento apoptótico o núcleo que se apresentou corado em marrom.
O índice de apoptose foi avaliado pelo mesmo sistema digital de captura de imagem utilizado para medir a altura das vilosidades. Foram escolhidos 10 campos aleatórios em aumento de 40 vezes para cada lâmina, sendo que o total de células coradas foi contado com o auxílio do Software Image tool®.
Índice mitótico
A expressão do antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA = proliferating cell
nuclear antigen)43, obtida por incubação dos fragmentos com o anticorpo PC10, sendo as lâminas contracoradas com 0,3% de verde metila, foi utilizada para a análise do índice mitótico. O índice de proliferação foi obtido pela avaliação do número de células marcadas por 1000 núcleos observados nas criptas do tubo intestinal do fragmento histológico de cada animal de experimentação
Protocolo 3
Os índices de apoptose e mitose de cada segmento de intestino foram anotados em ficha padronizada denominada Protocolo 3 (Figura 15).
PROCOTOLO 3
ÍNDICE DE APOPTOSE x MÉTODO PRESERVAÇÃO
Segmentos intestinais Ia Ib IIa IIb
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Observação: Índice de apoptose = números células em apoptose por 10 campos
ÍNDICE DE MITOSE x MÉTODO PRESERVAÇÃO
Segmentos intestinais Ia Ib IIa IIb
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Observação: Índice de mitose = números células em mitose por 1000 núcleos
Figura15 – Cópia da ficha padronizada para as anotações das observações histológicas do índice de apoptose e índice de mitose dos segmentos intestinais de cada animal de experimentação.
Estudo Estatístico
Os resultados obtidos da amostra foram enviados ao Curso de Matemática da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Santa Cecília, Disciplina de Bioestatística, onde recebeu tratamento estatístico.
Foram realizados os testes de Kolmogorov-Smirnov e Shapiro-Wilk44 para verificar se as variáveis quantitativas contínuas apresentavam distribuição normal. Para as que apresentaram distribuição normal, foram utilizados testes paramétricos, enquanto que para as de distribuição heterogênea, foram utilizados testes não-paramétricos.
Utilizou-se o Teste t de Student44 para 2 amostras independentes ao se compararem os Grupos I e II em relação ao peso dos animais, ao comprimento do intestino delgado, ao peso dos segmentos de intestino a serem preservados e ao intervalo de tempo entre o final da irrigação do lúmen intestinal e a ligadura da veia mesentérica, com o objetivo de se avaliar a homogeneidade da amostra. Com este mesmo objetivo, utilizou-se o Teste de Mann- Whitney45, ao se compararem os Grupos I e II em relação à duração da anestesia e ao tempo entre a ligadura da veia mesentérica e o início da perfusão vascular.
Utilizou-se o Teste de Wilcoxon45 para 2 amostras relacionadas ao se compararem os Grupos Ia e Ib, bem como os Grupos IIa e IIb com relação aos graus de lesão, alturas das vilosidades, índice de apoptose e de proliferação celular, objetivando-se avaliar a interferência da oxigenação hiperbárica na estrutura morfológica do intestino delgado durante a preservação.
Também com relação aos graus de lesão, altura das vilosidades, índice de apoptose e de proliferação celular, foram comparados tanto os Grupos Ia e IIa como os Grupos Ib e IIb pelo Teste de Mann-Whitney45 para 2 amostras independentes, para se avaliar a interferência do tempo de acondicionamento na estrutura morfológica do intestino.
Fixou-se em 0,05 ou 5% o nível de rejeição da hipótese de nulidade. Foram considerados estatisticamente significantes os valores de p < 0,05. Os resultados significantes foram destacados com asterisco (*). Ao lado dos resultados não significantes assinalou-se N.S. entre parênteses.
4. RESULTADOS
Tabela 8 – Comparação dos graus de lesão nos segmentos intestinais preservados hipotermicamente por 12 ou 24 horas e submetidos ou não à oxigenação hiperbárica. GRUPOS Ia Ib IIa IIb 6 2 6 3 6 2 7 4 6 3 7 3 6 3 7 4 6 3 7 4 6 2 6 3 6 3 6 3 6 3 6 4 6 2 7 4 6 2 7 4 Prova de Wilcoxon
Grupo Ia x Grupo Ib Grupo IIa x Grupo IIb Ia > Ib IIa > IIb
Z = 2,879* Z = 2,970* p = 0,002 p = 0,002
Teste de Mann-Whitney
Grupo Ia x Grupo IIa Grupo Ib x Grupo IIb Ia < IIa Ib < IIb
Z = 2,854* Z = 3,245* p = 0,01 p = 0,001
0 1 2 3 4 5 6 7 8
G
rau
d
e lesão
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Grupos
Grupo Ia
Grupo Ib
Gráfico 1 – Comparação dos graus de lesão nos segmentos intestinais preservados hipotermicamente por 12 horas e submetidos (Grupo Ib) ou não (Grupo Ia) à oxigenação hiperbárica.
0 1 2 3 4 5 6 7 8
G
rau
d
e
l
esão
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Grupos
Grupo IIa
Grupo IIb
Gráfico 2 – Comparação dos graus de lesão nos segmentos intestinais preservados hipotermicamente por 24 horas e submetidos (Grupo IIb) ou não (Grupo IIa) à oxigenação hiperbárica. Teste de Wilcoxon: IIa > IIb (p = 0,002).
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Gra
u
d
e
le
s
ã
o
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Grupos
Grupo Ia
Grupo IIa
Gráfico 3 – Comparação dos graus de lesão nos segmentos intestinais preservados hipotermicamente por 12 ou 24 horas e não submetidos à oxigenação hiperbárica (Grupos Ia e IIa, respectivamente). Teste de Mann-Whitney: Ia < IIa (p = 0,01).
0 1 2 3 4 5 6 7 8
G
rau
d
e l
esão
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Grupos
Grupo Ib
Grupo IIb
Gráfico 4 – Comparação dos graus de lesão nos segmentos intestinais preservados hipotermicamente por 12 ou 24 horas e submetidos à oxigenação hiperbárica (Grupos Ib e IIb, respectivamente). Teste de Mann- Whitney: Ib < IIb (p = 0,001).
Tabela 9 – Comparação das médias de histometria das vilosidades nos segmentos intestinais
GRUPOS
preservados hipotermicamente por 12 ou 24 horas e submetidos ou não à oxigenação hiperbárica (medidas em µm; 10 vilosidades por cada segmento).
Médias Ia Ib IIa IIb
1 19,07 166,53 7,87 140,68 6 18,20 181,24 21,35 134,63 7 19,28 166,70 8,08 140,85 2 19,93 167,35 8,73 141,50 3 9,77 159,35 16,28 121,15 4 17,90 181,21 21,35 146,26 5 9,25 158,83 15,76 112,12 8 10,29 159,88 16,81 113,17 9 16,90 179,91 20,05 133,33 10 20,79 168,25 9,59 142,40 Prova de Wilcoxon
Grupo Ia x G x Grupo IIb
Z Z
Teste de Mann-Whitney
Grupo Ia rupo IIb
Z = 0,166 (N.S.) Z