U/L Gsp (Panax ginseng C, peptídio

medicinal)

Uso potencial como droga contra diabetes

800.0 mg/L Proteinase de cisteína de milho

(Mir1)

Germinação, senescência Insolúvel/inativo

α-amylase (Amy 1A/3D) de arroz Hidrólise do amido 340.0 mg/L

β-D-fructofuranosidase (Osβfruct3)

de arroz

Hidrólise da sucrose 0.35 U/L

Solanum tuberosum (apyrase de

batata)

Fosfohidrolase,

inibição da agregação plaquetária

1.0 mg/L Taumatina II Thaumatococcus daniellii Proteína “sweet-tasting” 25 mg/L Vírus Nucleoproteína do vírus do sarampo (MeN)

Responsável pelo empacotamento do genoma viral

29% de proteína total

A levedura Pichia pastoris é um organismo metilotrófico, ou seja, é capaz de utilizar o metanol como única fonte de carbono ou energia. De todas as linhagens de levedura identificadas, são conhecidos apenas 4 gêneros que apresentam o metabolismo do metanol:

Hansenula, Pichia, Cândida e Torulopsis (Faber et al, 1995). As primeiras reações do

metabolismo metanólico para obtenção de energia ocorrem nos peroxissomos e depois prosseguem no citoplasma. A enzima álcool oxidase – AOX (codificada pelos genes AOX1 e

AOX2, sendo o primeiro, responsável pela maior atividade da enzima na célula) (Ellis et al,

1985) é a primeira a atuar, oxidando o etanol a formaldeído e a peróxido de hidrogênio, que por sua vez é degradado a oxigênio e água. Uma parte do formaldeído deixa o peroxissomo e vai para o citoplasma, onde é oxidado a formato e carbono por duas desidrogenases (Cereghino & Cregg, 2000).

O metanol pode ser sintetizado a partir do gás natural metano, de forma relativamente barata, e foi por este motivo que, no ano de 1970, a Phillips Petroleum Company desenvolveu meios e métodos para cultivo desta levedura, no intuito de transformá-la numa fonte de alimento animal, como Single cell protein - SCP (Wegner, 1990). Após a crise do óleo, no mesmo período, o custo do metano aumentou dramaticamente, tornando inviável a produção de SCP por P. pastoris. Em 1980, a companhia de petróleo, junto ao Salk Institute

Biotechnology/Industrial associates Inc. (SIBIA, La Jolla, CA, USA) decidiu transformar a

levedura em um sistema de produção de proteínas recombinantes. No ano de 1993, a patente foi passada para a RCT (Research Corporation Technology- Tucson, AZ), e a Invitrogen

Corporation (Carlsbad, CA, USA) foi licenciada para vender o sistema de expressão na forma

de kit (Macauley-Patrick et al, 2005; Cereghino & Cregg, 2000).

Existem linhagens de Pichia que têm o seu genótipo modificado para atender diferentes aplicações. Exemplos disto são as linhagens GS115 e KM71 que apresentam o gene da histidina desidrogenase (his4) inativo, funcionando assim, como uma marca de seleção para os transformantes (Daly & Hearn, 2004). Os fenótipos associados ao metabolismo do metanol variam em relação ao consumo lento ou normal da fonte de carbono, que depende da interrupção ou não do gene AOX1, respectivamente. Linhagens que apresentam o gene AOX1 intacto (responsável por 85% da utilização do metanol) têm fenótipo Mut+ (Methanol

utilization plus) com taxa de crescimento no metanol igual ao tipo selvagem (Cereghino &

utilization slow) cresce e usa o metanol de maneira mais lenta por apresentar o gene AOX1

interrompido e assim, utilizar o AOX2 que tem uma atividade menor no metabolismo metanólico. A escolha do fenótipo varia pelo tipo de proteína expressa e formas de estratégias utilizadas, sendo assim, existem pesquisadores que utilizam o fenótipo Mut+ (Hohenblum et

al, 2004; Slibinskas et al, 2004), ou o Muts (Aoki et al, 2003; McKinney et al, 2004).

Os vetores de expressão gênica para uso com a levedura P. pastoris estão bem estabelecidos e têm sido utilizados com sucesso para produção de diferentes tipos de proteínas heterólogas (Higgins, 1995). A maioria dos vetores possuem um cassete de expressão composto pela seqüência promotora do gene AOX1 (AOX1 5’), um ou mais sítios de clonagem para inserção do gene heterólogo, uma seqüência de término da transcrição do gene

AOX1, seqüências para integração no genoma, para seleção e secreção (Daly & Hearn, 2004).

Além do promotor AOX1 existem outros alternativos que podem ser mais indicados para expressão de certos tipos de proteínas, são eles: GAP, FLD1, PEX8 e YPT1. Sistemas que utilizam vetores com o promotor GAP (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) necessitam de glicose como fonte de carbono e são amplamente utilizados apresentando níveis de expressão semelhantes ou até maiores dos observados com o promotor AOX1 (Waterham et al, 1997), porém, por ser constitutivo, ele só é apropriado para proteínas recombinantes que não sejam tóxicas às células. Os promotores YPT1, induzido por manitol (Sears et al, 1998) e construído a partir do gene da GTPase, e o PEX8, proteína da matriz peroxisomal (Liu et al, 1995), não são muito utilizados, provavelmente pelos baixos níveis de expressão obtidos (Cereghino & Cregg, 2000). O promotor FLD1 é originado do gene que codifica a enzima formaldeído desidrogenase que participa do metabolismo do metanol. Ele pode ser induzido por metanol, metilamina ou ambos, o que resulta em um alto nível de produção (Resina et al, 2004), sendo uma alternativa atrativa para expressão heteróloga (Shen

Vantagens Desvantagens

A transcrição de proteínas heterólogas é fortemente controlada por um mecanismo de repressão/ desrepressão

O monitoramento dos níveis de metanol durante a indução é um problema freqüente, devido a imprecisão de sondas

Altos níveis de proteína heteróloga podem ser obtidos, ainda que a mesma seja tóxica à célula

Metanol é um produto inflamável, de modo que, para a indústria, não é uma característica desejável à produção

A repressão da transcrição do gene heterólogo por uma fonte inicial de carbono assegura a obtenção de um bom crescimento celular antes da sobrecarga de expressão do gene

Metanol é principalmente derivado de uma fonte petroquímica, cujo envolvimento em produção de alimentos ou insumos médicos é evitado quando possível

A indução da transcrição é prontamente alcançada pela adição de metanol ao meio de cultura

Duas fontes de carbono são necessárias, uma vez que o processo é dividido em duas etapas (crescimento/ indução), havendo necessidade de troca dos meios de cultura em um ponto específico

Tabela 1. Vantagens e desvantagens do uso do promotor AOX1 para expressão heteróloga; Adaptado de Macauley-Patrick, 2005.

O sistema de expressão baseado nas células de P. pastoris apresenta características peculiares que exercem algumas vantagens sobre os outros. As suas células são de fácil manipulação genética; podem produzir grandes quantidades de proteínas, no espaço intracelular ou extracelular; atingem altas densidades em meios mínimos e de baixo custo e realizam modificações pós-trasducionais semelhantes aos mamíferos (Macauley-Patrick et al, 2005). Além disso, esta levedura tem um padrão de glicosilação similar ao das células animais e não promove hiperglicolisação como a Saccharomyces cerevisiae (Torres & Moraes, 2002). Por apresentar tais características, algumas proteínas que não são expressas com eficiência em bactéria, S. cerevisiae ou baculovírus, são obtidas com sucesso e na forma funcional ativa através das células de P. pastoris (Cereghino et al, 2001).

A fermentação com Pichia pode ser feita facilmente em larga escala para atender a demandas maiores, e os parâmetros que influenciam a produção e atividade da proteína,

como: pH, aeração e quantidade de carbono, podem ser bem controlados (Higgins & Cregg, 1998). Outra vantagem do sistema com P. pastoris é a possibilidade de reprimir a expressão da proteína heteróloga (se for tóxica à célula, em altos níveis) já que o promotor AOX1 é fortemente reprimido nas células que crescem com glicose e outras fontes de carbono, sendo induzido 1000 vezes quando as células são submetidas a um meio onde o etanol é a única fonte de carbono (Cereghino et al, 2002).

No sistema com Pichia, a expressão extracelular é bastante utilizada por que a levedura secreta baixos níveis de proteínas nativas e por isto a purificação da proteína heteróloga se faz de maneira simples. A produção intracelular geralmente não resulta em glicosilação, sendo assim, mais atrativo para certos tipos de proteínas, como fármacos. Todavia, a purificação das proteínas expressas dentro da célula é mais difícil quando comparada a expressão extracelular (Rees et al, 1999).

No entanto, a principal vantagem da utlização da P. pastoris, principalmente quando comparada a S. cerevisae, para a produção de L1 de HPV16, está na reduçaõ do preço do produto final, já que a patente existente envolve apenas a produção de VLPs a partir de células de S. cerevisae.