Vật liệu nghiên cứu:
Các hoá chất sử dụng trong nghiên cứu có độ tinh sạch cao được dùng để pha môi trường nuôi cấy VSV và môi trường SOT.
Các môi trường nuôi cấy VSV như sau:
- Môi trường MPA (để xác định số lượng vi khuẩn dị dưỡng hiếu khí tổng số):
42
Pepton: 10 g
Thạch: 20 g
Nước: 1 lít
- Môi trường Hasen tinh bột (để xác định số lượng vi khuẩn và nấm men có khả năng phân giải tinh bột): Tinh bột: 50 g Pepton: 5 g MgSO4.7H2O: 3 g KH2PO4: 3 g K2HPO4: 3 g Cao nấm men: 1 g Thạch: 20 g Nước: 1 lít
- Môi trường Gause tinh bột (để xác định số lượng xạ khuẩn có khả năng phân giải tinh bột): Tinh bột: 20 g K2HPO4: 0,5 g MgSO4.7H2O: 0,5 g NaCl: 0,5 g KNO3: 1 g FeSO4: 0,01 g (Vết) Thạch: 20 g Nước: 1 lít
Trong đó có bổ sung K2Cr2O7 (0,5 g/l) vào môi trường nhằm ức chế sự phát
triển của vi khuẩn.
- Môi trường Czapecdox tinh bột (để xác định số lượng nấm mốc có khả năng phân giải tinh bột):
Tinh bột: 30 g
43 MgSO4 0,5 g KH2PO4: 1 g KCl: 0,5 g FeSO4: 0,01 g (Vết) Thạch: 20 g Nước: 1 lít - Môi trường xác định VSV kị khí tổng số: Pepton: 4 g/l Glucoza: 10 g/l MgSO4: 1 g/l Na2SO4: 7,5 g/l NaCl: 1g/l MgCl2: 0,5 g/l Thạch: 12 g/l Fe2(SO4)3.6H2O hoặc (NH4)2SO4: 0,05 g/l
- Thành phần môi trường SOT dùng để giữ giống tảo lam Spirulina platensis CNTĐB được chỉ ra trong bảng 3. Bảng 3. Thành phần môi trường SOT Dung dịch A Hoá chất Lượng cho 1 lít môi trường 1. NaHCO3 16,8 g 2. K2HPO4 0,5 g Dung dịch B 1. NaNO3 2,5 g 2. K2SO4 1 g 3. NaCl 1 g 4. MgSO4.7H2O 0,2 g 5.CaCl2.2H2O 0,04 g 6. FeSO4.7H2O 0,01 g
44
7. Na2EDTA 0,08 g
8. Dung dịch A5 1 ml
Thành phần các hóa chất có trong 1 lít dung dịch A5 như sau:
H3BO3 : 2,86 g
MnSO4.7H2O: 2,5 g
ZnSO4.7H2O: 0,222 g
CuSO4.5H2O: 0,079 g
Na2MoO4.2H2O: 0,021 g
Các hóa chất trong dung dịch A5 được cân với trọng lượng xác định như trên,
sau đó tiến hành định mức bằng nước cất đến 1 lít.
Cách pha môi trường SOT: Cân các hoá chất của dung dịch A và B định mức đến 1 lít tương ứng. Khử trùng dung dịch A và B ở điều kiện1210C trong 15 phút.
Sau đó phối trộn 1 thể tích dung dịch A với 1 thể tích dung dịch B với nhau.
- Trang thiết bị sử dụng trong nghiên cứu: Các thiết bị đã được sử dụng trong thí nghiệm bao gồm: kính hiển vi quang học Olympus CH 02 (Nhật Bản), cân kỹ thuật Precisa XB 1200C, cân phân tích Precisa XT 220A, máy đo mật độ quang học UV-1601 Shimazu (Nhật Bản), tủ sấy Cornthem (New Zealand), máy lắc IKA KS 260 basic (Đức), máy ly tâm Sorvall (R) (Đức), box cấy vô trùng Lamin Air, Holten
loại HH48-OSI (Đức), máy ảnh kĩ thuật số Canon IXY Digital 70 (Nhật Bản), máy phân tích sắc ký khí với đầu dò JGC-20K (Nhật Bản), đèn ống UV loại MEDICOM, BLF-12, 220V, 50 Hz, 30 Wat của Hungari sử dụng với bước sóng 254nm và các dụng cụ thuỷ tinh gồm các bình tam giác, pipet, ống nghiệm, đĩa petri (đường kính 10 cm).
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Phương pháp xác định số lượng các nhóm VSV trong nước thải và trong bùn hoạt tính
2.2.1.1 Phương pháp xác định vi sinh vật hiếu khí phân giải tinh bột tổng số Chuẩn bị các môi trường nuôi cấy VSV, sau đó môi trường được đun tới khi tan hết tinh bột và thạch. Tiếp theo, môi trường được chuyển vào các bình tam giác,
45
được khử trùng ở điều kiện 0,8 atm ở 1210C trong 30 phút. Sau khi khử trùng, để
thạch nguội đến khoảng 500C, tiến hành đổ ra đĩa petri. Lượng thạch đổ vào mỗi đĩa
khoảng 15 – 20 ml, sau đó sấy khô mặt thạch trong tủ sấy trong 30 phút.
Lấy 1 ml mẫu nước thải sản xuất bún cho vào ống nghiệm đựng 9 ml nước cất vô trùng, được nồng độ pha loãng 10-1. Tiến hành lắc đều ống nghiệm, sau đó
lấy 1 ml dung dịch có nồng độ pha loãng 10-1 cho vào ống nghiệm chứa 9 ml nước
cất vô trùng, được nồng độ pha loãng 10-2. Cứ tiếp tục như vậy tiến hành pha loãng
đến độ pha loãng cần thiết. Sau đó, dùng pipet man lấy 50µl dung dịch mẫu nước thải đã pha loãng ở nồng độ cần thiết nhỏ vào chính giữa đĩa thạch đã chuẩn bị như đã nêu ở trên. Sau đó, các đĩa thạch được đậy lại và bao gói kín bằng giấy, đặt trong tủ ấm ở 28 - 300C. Sau 2 – 5 ngày lấy đĩa ra quan sát và đếm số lượng khuẩn lạc đã
mọc.
Công thức tính số lượng VSV (CFU/ml dung dịch) như sau: X = A x 20 x 10n
A: Số khuẩn lạc mọc trên mặt thạch; 10n: Nghịch đảo nồng độ pha loãng;
X: Số lượng VSV (CFU/ml dung dịch); CFU: là đơn vị hình thành khuẩn lạc.
2.2.1.2 Phương pháp xác định vi sinh vật kỵ khí phân giải tinh bột tổng số - Xác định số lượng VSV kỵ khí theo phương pháp MPN (The Most Probable Number Method). Phương pháp MPN còn được gọi là phương pháp pha loãng tới hạn hay phương pháp chuẩn độ. Đây là phương pháp dùng để đánh giá số lượng VSV theo số lượng VSV có xác suất lớn nhất hiện diện trong một đơn vị thể tích mẫu. Đây là phương pháp định lượng dựa trên kết quả định tính của một loạt thí nghiệm được lặp lại ở một số độ pha loãng khác nhau. Thông thường, việc định lượng này được thực hiện lặp lại 3 lần ở 3 độ pha loãng bậc 10 liên tiếp, tổng cộng 3 x 3 = 9 ống nghiệm. Cho vào các ống nghiệm có chứa môi trường thích hợp cho sự tăng trưởng của đối tượng VSV cần định lượng một thể tích chính xác dung dịch mẫu ở 3 nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp. Ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp.
46
Dựa vào kết quả biểu kiến chứng minh sự tăng trưởng của VSV cần kiểm định trong từng ống nghiệm, ghi nhận số lượng các ống nghiệm dương tính ở từng độ pha loãng. Sử dụng các số liệu này và dựa vào bảng Mac Crady (bảng 4) suy ra mật độ VSV được trình bày dưới dạng số MPN/100ml hay số MPN/1g mẫu.
Quy trình thực hiện việc xác định số lượng VSV kỵ khí như sau:
- Pha loãng mẫu nước thải: Dùng nước muối sinh lý (0,85% NaCl) để pha loãng. Cách pha loãng như sau: Lấy 0,5 ml mẫu nước thải và bổ sung thêm 4,5 ml nước muối sinh lý trên sẽ được dung dịch nước thải có nồng độ pha loãng 10-1. Sau đó lại
lấy 0,5 ml dung dịch này bổ sung thêm 4,5 ml nước muối sinh lý, khi đó được dung dịch nước thải có nồng độ 10-2. Cứ tiếp tục như vậy, thu được nước thải với nồng độ
pha loãng từ 10-3 đến 10-9.
- Cách cấy mẫu: Hút 1 ml dung dịch nước thải được pha loãng ở các nồng độ 10-1
đến 10-9, bổ sung vào môi trường thạch đã được đổ đầy ống nghiệm. Chú ý tránh
tạo bọt khí, ống nghiệm được đậy chặt bằng nút cao su và dùng băng dính bọc ngoài nút. Sau đó, các ống nghiệm được để ở tủ ấm 370C trong khoảng từ 7 – 10 ngày.
Sau 3 ngày nuôi, có thể lấy mẫu ra quan sát khả năng mọc của các VSV kỵ khí. Khi đó vi khuẩn yếm khí mọc thành các khuẩn lạc nhỏ, màu trắng nằm rải rác trong thạch, ngoài ra, có khả năng một số mẫu có mặt các vi khuẩn sinh metan làm cho thạch bị nứt, đứt đoạn nhiều nơi. Tra bảng 4 để xác định số lượng VSV kỵ khí.
Bảng 4. Bảng tra MPN dùng cho loạt 3 ống nghiệm ở 3 nồng độ pha loãng liên tiếp
Số lượng ống dương tính Số MPN/ 100 ml Số lượng ống dương tính Số MPN/ 100 ml Số ml mẫu sử dụng Số ml mẫu sử dụng 10 1 0,1 10 1 0,1 0 0 0 - 2 0 0 9 0 0 1 3 2 0 1 14 0 0 2 6 2 0 2 20 0 0 3 9 2 0 3 26 0 1 0 3 2 1 0 15
47 0 1 1 6 2 1 1 20 0 1 2 9 2 1 2 27 0 1 3 12 2 1 3 34 0 2 0 6 2 2 0 21 0 2 1 9 2 2 1 28 0 2 2 12 2 2 2 35 0 2 3 16 2 2 3 42 0 3 0 9 2 3 0 29 0 3 1 13 2 3 1 36 0 3 2 16 2 3 2 44 0 3 3 19 2 3 3 53 1 0 0 4 3 0 0 23 1 0 1 7 3 0 1 39 1 0 2 11 3 0 2 64 1 0 3 15 3 0 3 95 1 1 0 7 3 1 0 43 1 1 1 11 3 1 1 75 1 1 2 15 3 1 2 120 1 1 3 19 3 1 3 160 1 2 0 11 3 2 0 93 1 2 1 15 3 2 1 150 1 2 2 20 3 2 2 210 1 2 3 24 3 2 3 290 1 3 0 16 3 3 0 240 1 3 1 20 3 3 1 460 1 3 2 24 3 3 2 1100 1 3 3 29 3 3 3 - [Nguồn: Trần Linh Thước, 2002]
48
Bùn hoạt tính được nuôi tạo từ nước thải sản xuất bún được lấy ở cống chung cuối làng Phú Đô theo phương thức sau:
Lấy 1 lít nước thải sản xuất bún ở cống thải chính làng nghề bún Phú Đô để lắng 1 ngày. Sau đó gạt phần nước trong, còn lại 200 ml nước cặn. Lấy 50 ml dung dịch cặn này cho vào 40 ml nước thải sản xuất bún được lấy ở cống chung cuối làng. Sau đó tiến hành bổ sung vào dung dịch trên các hóa chất sau:
- Đường kính: 10 g
- Pepton: 1,0 g
- MgSO4.7H2O: 0,6 g
- KH2PO4: 0,6 g
- Cao nấm men: 0,2 g
Tiếp theo, bổ sung thêm nước máy cho đủ 200 ml. Tiến hành trung hòa dung dịch nêu trên bằng dung dịch NaOH 0,1 M đến khi được pH = 7. Chuyển toàn bộ 200 ml dung dịch nêu trên vào bình tam giác có dung tích 500 ml, đặt trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút, nhiệt độ 28 – 300C trong 48 giờ. Sau khoảng thời gian lắc
nêu trên, bình tam giác chứa dung dịch bùn được để lắng, bùn hoạt tính thu được là cặn bùn trong bình tam giác.
2.2.3 Phương pháp xác định các thông số xử lý nước thải tối ưu 2.2.3.1 Phương pháp xác định thời gian lắng tối ưu
Để xác định thời gian lắng tối ưu, chúng tôi tiến hành lấy 10 lít nước thải sản xuất bún ở cống chung cuối làng bún Phú Đô. Lượng nước này được đưa vào một can nhựa để vào một nơi cố định. Kiểm tra pH của nước thải bằng giấy quỳ đo pH. Tiến hành chia đều lượng nước thải này vào 7 can nhựa, mỗi can nhựa chứa 1 lít nước thải. Nước thải trong 7 can nhựa này lần lượt được để lắng tại các thời điểm: 0, 6, 12, 14, 16, 18 và 24 giờ. Sau đó tiến hành trang đĩa để kiểm tra số lượng VSV trong các mẫu nước thải tương ứng với các khoảng thời gian để lắng nói trên. Dựa vào kết quả số lượng VSV thu được, chúng tôi tìm ra thời gian lắng hiệu quả nhất. 2.2.3.2 Phương pháp xác định tỷ lệ bùn hoạt tính tối ưu cho quá trình xử lý
49
Mẫu nước thải sản xuất bún ở cống chung cuối làng được lấy về, sau khi kiểm tra và điều chỉnh pH về giá trị trung tính, để lắng khoảng 1 ngày, nước thải được chia làm năm phần bằng nhau và cho vào 5 bình tam giác dung tích 500ml. Các bình được bổ sung tương ứng 2, 3, 4 và 5 và 7% bùn hoạt tính, và lắc mẫu trên máy lắc có tốc độ 200 vòng/phút, nhiệt độ 28 – 30 0C trong 24 giờ. Sau khi lắc các
bình tam giác được lấy ra, để lắng 30 phút, rồi dùng pipet để hút phần cặn bùn và tiến hành cấy trải trên đĩa thạch. Dựa số lượng VSV thu được ở 5 mẫu trên, chúng tôi xác định được tỷ lệ bùn hoạt tính tối ưu cho quá trình xử lý.
2.2.3.3 Phương pháp xác định nồng độ nitơ tối ưu
Nước thải sau khi đã để lắng và bổ sung bùn hoạt tính theo tỷ lệ tối ưu đã xác định được ở trên được bổ sung tiếp phân lân. Sau đó, chia dung dịch thành 5 phần bằng nhau vào 5 bình tam giác dung tích 1 lít. Tiếp tục bổ sung phân đạm với hàm lượng khác nhau: 40, 70, 100, 130 và 160 mg/l vào 5 bình tam giác nêu trên. Tiếp theo, cả 5 bình tam giác trên được lắc trên máy lắc có tốc độ 200 vòng/phút, nhiệt độ 28 – 300C trong 1 ngày. Sau đó, tiến hành xác định số lượng VSV ở cả 5 mẫu
trên. Dựa trên số lượng VSV thu được trong 5 mẫu, chúng tôi xác định được lượng N cần bổ sung tối ưu.
2.2.3.4 Phương pháp xác định nồng độ photpho tối ưu
Các bước được tiến hành tương tự như phần xác định nồng độ N tối ưu: Nước thải sau khi đã để lắng, bổ sung bùn hoạt tính và phân đạm theo tỷ lệ tối ưu như đã xác định ở phần trên vào. Sau đó, chia nước thải thành 5 phần bằng nhau vào 5 bình tam giác dung tích 1 lít. Tiếp tục bổ sung phân lân theo các nồng độ khác nhau: 50, 80, 110, 140 và 170 mg/l vào 5 bình tam giác nêu trên. Sau đó, cả 5 bình tam giác trên cũng được lắc trên máy lắc có tốc độ 200 vòng/phút, nhiệt độ 28 – 30
0C trong 1 ngày và tiến hành xác định số lượng VSV ở cả 5 mẫu trên. Dựa trên số
lượng VSV thu được, lượng P tối ưu cần bổ sung được xác định. 2.2.3.5 Phương pháp xác định thời gian sục khí tối ưu
Sau khi tìm ra các điều kiện tối ưu về N và P, chúng tôi tiến hành xử lý mẫu nước thải trong các bình xử lý dung tích 10 lít. Quá trình sục khí được thực hiện
50
trong thời gian 24 giờ. Trong quá trình sục khí tiến hành lấy mẫu nước ở các thời gian: 0, 4, 10, 16, 20 và 24 giờ. Sau đó xác định số lượng VSV tổng số phân hủy tinh bột ở tất cả các mẫu trên để tìm ra thời gian sục khí tối ưu cho quá trình xử lý. 2.2.4. Xác định tốc độ sinh trưởng phát triển của tảo lam Spirulina platensis bằng phương pháp đo mật độ quang học (OD) tại bước sóng 420 nm
- Chủng tảo lam Spirulina platensis CNTĐB được nuôi trong các điều kiện thí nghiệm như sau: sử dụng môi trường SOT có thành phần được chỉ ra trong bảng 3, nhiệt độ nuôi từ 27-300C; pH môi trường ban đầu từ 8,5 - 9,0; cường độ chiếu
sáng là 10 klux; chu kỳ chiếu sáng: tối là 12/12giờ; thể tích dịch nuôi: 1 - 2 lít; mật độ ban đầu được đo ở bước sóng 420 nm (là cực đại hấp thụ của sắc tố chlorophyll). Viêc đo OD của tảo S. platensis được thực hiện 1 lần/1 ngày.
- Xác định tốc độ sinh trưởng của tảo thông qua đo mật độ quang học ở bước sóng 420nm (OD420) bằng máy UV – 1601 Shimadzu (Nhật Bản).
- Chụp ảnh hình thái của tảo bằng máy ảnh kỹ thuật số Canon IXY Digital 70 (Nhật Bản) dưới kính hiển vi quang học Olympus CH 02 (Nhật Bản).
2.2.5. Xác định hiệu quả xử lý nước thải sau từng giai đoạn
- Các thông số COD, BOD5, Nts, Pts được xác định theo phương pháp chuẩn
xác định thành phần hóa lý trong môi trường nước: COD (SMEWW 5220C:1999), BOD5 (TCVN 6001:1995), Nts (TCVN 5987:1995), Pts (SMEWW 4500-P-B:1999).
Ở từng công đoạn xử lý: trước khi có sục khí, sau thời gian sục khí có bổ sung bùn hoạt tính và sau khi nuôi tảo đều tiến hành xác định cả bốn thông số COD, BOD5,
51
Hình 5. Sơ đồ thí nghiệm xử lý nước thải sản xuất bún ở làng nghề