Híbridos somáticos de C sinensis + C grandis

Híbridos somáticos foram obtidos nas combinações entre laranja ‘Hamlin’ com toranja enxertada ‘Indian Red’ e entre laranja ‘Hamlin’ com ‘seedling’ selecionado de toranja ‘Singapura’.

Foram obtidas 4 plantas de laranja ‘Hamlin’ com toranja enxertada ‘Indian Red’, das quais duas foram comprovadas como híbridos alotetraplóides (Figuras 3a e 3b). As outras duas, foram identificadas como plantas diplóides (2n=2x=18 cromossomos). A diploidia destas plantas e a semelhança com o parental não- embriogênico (toranja), quanto à mofologia foliar, levantou a hipótese de cibridização, cuja análise de comprovação ainda não foi concluída.

Duas plantas foram regeneradas da fusão entre laranja ‘Hamlin’ + ‘seedling’ selecionado de toranja ‘Singapura’, tendo sido comprovada a hibridação somática em apenas uma delas (Figura 3c). A outra planta apresentou tetraploidia (2n=4x=36 cromossomos), não tendo sido constatada a hibridação pela análise molecular (RAPD). Além disto, esta planta apresenta

Figura 3 - Plantas regeneradas a partir da fusão de protoplastos. a-b) Híbridos somáticos de laranja ‘Hamlin’ + toranja enxertada ‘Indian Red’; c) Híbrido somático de laranja ‘Hamlin’ + ‘seedling’ de toranja ‘Singapura’; d) Planta tetraplóide resultante da fusão de laranja ‘Hamlin’ + ‘seedling’ de toranja ‘Singapura’.

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b

morfologia foliar idêntica à do parental não-embriogênico, o que sugere a regeneração de um autotetraplóide do ‘seedling’ de toranja ‘Singapura’, cuja confirmação requer uma análise mais detalhada.

As plantas resultantes da fusão de laranja ‘Hamlin’ + toranja enxertada ‘Indian Red’ apresentaram um rápido desenvolvimento, com calos vigorosos e um grande número de embriões mal formados. No entanto, a taxa de conversão dos embriões em plantas foi baixa. A fim de induzir o desenvolvimento da parte aérea, os embriões foram cortados e transferidos para meio DBA3, constituído pelo meio

MT (Murashige & Tucker, 1969), modificado pela adição de 0,01 mg.l-1 de 2,4-D e 3 mg.l-1 de BAP (Deng et al., 1992). Foram regeneradas plantas que não enraizaram e, portanto, não foram aclimatizadas. É possível que a rota de desenvolvimento destas plantas tenha ocorrido via organogênese pela formação de gemas na superfície dos cotilédones deformados, em detrimento aos embriões. Louzada et al. (1992) reportaram a regeneração de híbridos somáticos regenerados por organogênese, pela transferência de segmentos de embrião das combinações tangerina ‘Cleópatra’ + limão ‘Cravo’ e laranja azeda + limão ‘Volkameriano’ para meio de cultura com BAP. Mourão Filho (1995) relatou a regeneração de plantas via organogênese em fusões envolvendo laranja ‘Succari’ + Clausena lansiun e tangor ‘Murcote’ + Clausena lanciun em meio CW-32.

Comportamento semelhante foi observado na regeneração de plantas a partir de protoplastos resultantes da fusão entre laranja ‘Hamlin’ + ‘seedling’ de toranja ‘Singapura’. Evans (1983) comenta que, embora a fusão de protoplastos seja um processo inespecífico, nem todas as combinações de genótipos resultam na formação de plantas normais, o que deve estar relacionado a uma possível incompatibilidade somática dos genótipos.

Goh et al. (1995) regeneraram plantas de toranja ‘Thai’ a partir de explantes de segmentos caulinares, radiculares, discos foliares, discos cotiledonares e ápice meristemático, em meio com BAP, o que sugere haver alguma influencia da fusão dos genomas na regeneração de plantas por organogênese. Entretanto, Huang et al. (1988) também utilizaram BAP no meio de

cultura para regeneração de tecidos nucelares de toranja ‘Ma Dou Bai You’, onde obtiveram menos de 1% de brotos.

Estes mesmos explantes de toranja ‘Ma Dou Bai You’ geraram estruturas mal formadas, que foram identificadas como embriões que, por sua vez, desenvolveram estruturas de morfologia atípica, semelhantes à pseudobulbilhos, que necrosaram e morreram. Neste trabalho, foi realizada uma série de experimentos com embriogênese somática, onde não obtiveram sucesso na regeneração utilizando galactose, glicerol ou giberelina no meio de cultura, reduzindo o teor de sacarose e, nem mesmo, submetendo as culturas à estresse térmico. Nestas condições, os raros brotos formados mostraram-se alongados, com poucas e pequenas folhas, que logo necrosaram, não ocorrendo formação de raízes. O mesmo comportamento foi observado no presente trabalho, demonstrando a influência negativa do genótipo na regeneração das culturas provenientes de fusões de protoplastos.

Outro aspecto deve ser considerado, em relação à baixa taxa de conversão dos embriões somáticos obtidos neste trabalho. A espécie C. grandis é sabidamente produtora de uma série de substâncias classificadas como alcalóides e coumarinas (Wu, 1988; Huang et al., 1989). Estes compostos afetam muitas atividades das plantas e podem controlar alguns processos do crescimento (Van Sumere et al., 1972), inibindo a germinação de sementes e o alongamento de raízes (Juntilla, 1975). Kupidlowska et al. (1994) estudaram os efeitos de coumarinas no alongamento de raízes e na ultraestrutura de protoplastos de células meristemáticas de Cucumis sativus L., Pisum sativum L. e Zea mays L., concluindo que estas substâncias afetaram significativamente o desenvolvimento destas espécies, alterando o sistema de endomembranas, principalmente dictiossomas e retículo endoplasmático. Segundo os autores, estas substâncias estimularam a fragmentação de cisternas do retículo endoplasmático e reduziram o número de dictiossomas, os quais se tornaram menos ativos. Além disto, a matrix mitocondrial se tornou condensada, indicando uma possível redução de energia nas células.

As plantas morfologicamente normais, com bom desenvolvimento de parte aérea, foram transferidas para meio de enraizamento (RMAN), onde ocorreu a formação de pelo menos uma raiz principal por planta, que puderam ser aclimatizadas com sucesso. Algumas plantas não enraizaram ou apresentaram má formação de parte aérea, não tendo sobrevivido à aclimatização. As plantas foram transferidas para vasos com substrato e mantidas sob condições controladas de temperatura e umidade relativa por um período que variou de 30 a 60 dias, tendo sido transferidas, posteriormente, para casa-de-vegetação. Barlass & Skene (1982) também transferiram plantas de Citrus regeneradas in

vitro para condições de alta umidade relativa em vasos com terra e húmus, por

pelo menos 3 semanas, antes de serem transferidas definitivamente para casa- de-vegetação.

4.4 Confirmação da hibridação somática

4.4.1 Análise citológica

As análises mitóticas de células somáticas de ponta de raiz das plantas regeneradas permitiram a identificação de plantas tetraplóides, com 2n=4x=36 cromossomos, não evidenciando, entretanto, a natureza híbrida das plantas (Figuras 4a e 5a).

Os cromossomos de citros são muito semelhantes entre si e de tamanho bastante reduzido, até mesmo quando visualizados em microscópio ótico com aumento de 1250x. Segundo Guerra (2000), o tamanho do genoma de Citrus foi estimado em 0,61 pg de DNA para a espécie C. sinensis, o que significa um genoma quase 30 vezes menor que o de trigo e de cebola.

Esta análise tem sido utilizada como técnica auxiliar na confirmação da hibridação somática de Citrus e gêneros relacionados, observando-se, nestes, a natureza tetraplóide (2n=4x=36 cromossomos) (Tusa et al., 1990; Louzada et al., 1993; Moriguchi et al., 1996).

P 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 P

Figura 4 - Caracterização do híbrido somático de laranja ‘Hamlin’ + toranja enxertada ‘Indian Red’. a) Célula contendo 36 cromossomos; b) Morfologia foliar da planta híbrida e de seus parentais; c) Fragmentos RAPD. Colunas 1 a 3 = ‘primer’ OPAA4; colunas 4 a 6 = ‘primer’ OPAA10; colunas 7 a 9 = ‘primer’ OPAA15; colunas 10 a 12 = ‘primer’ OPAA18. Colunas 1, 4, 7 e 10 = laranja ‘Hamlin’; colunas 2, 5, 8 e 11 = híbrido somático de laranja ‘Hamlin’ + toranja enxertada ‘Indian Red’; colunas 3, 6, 9 e 12 = toranja enxertada ‘Indian Red’. P = ‘leadder’ 1Kb. Setas indicam bandas monomórficas.

c

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P 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 P

Figura 5 - Caracterização do híbrido somático de laranja ‘Hamlin’ + ‘seedling’ de toranja ‘Singapura’. a) Célula contendo 36 cromossomos; b) Morfologia foliar da planta híbrida e de seus parentais; c) Fragmentos RAPD. Colunas 1 a 3 = ‘primer’ OPAA1; colunas 4 a 6 = ‘primer’ OPAA2; colunas 7 a 9 = ‘primer’ OPAA7; colunas 10 a 12 = ‘primer’ OPAA10. Colunas 1, 4, 7 e 10 = laranja ‘Hamlin’; colunas 2, 5, 8 e 11 = híbrido somático de laranja ‘Hamlin’ + ‘seedling’ de toranja ‘Singapura’; colunas 3, 6, 9 e 12 = ‘seedling’ de toranja ‘Singapura’. P = ‘leadder’ 1Kb. Setas indicam bandas monomórficas.

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b

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4.4.2 Análise morfológica

A morfologia das folhas dos híbridos somáticos resultantes da fusão de protoplastos de laranja ‘Hamlin’ + toranja enxertada ‘Indian Red’ é apresentada na Figura 4b e do híbrido somático de laranja ‘Hamlin’ + ‘seedling’ de toranja ‘Singapura’, na Figura 5b.

A morfologia dos híbridos, geralmente, é intermediária à dos parentais. Características como plantas com folhas mais espessas, arredondadas, normalmente mais escuras e com pecíolo alado maior ou intermediário aos parentais, glândulas de óleo aparentes na face foliar abaxial, podem ser comparadas com os parentais, para comprovação da hibridação. Estas características são esperadas em plantas tetraplóides, uma vez que possuem maior número de cromossomos e, consequentemente, maior volume celular e nuclear (Cameron & Frost, 1968; Ramalho et al., 1990). Entretanto, Grosser & Gmitter Junior (1990a) comentam que a identificação de plantas híbridas somáticas entre espécies do gênero Citrus pode ser bem mais difícil do que no caso de híbridos intergenéricos.

Vários autores vêm utilizando a análise morfológica foliar em trabalhos de hibridação somática de Citrus e gêneros afins (Tusa et al., 1990; Louzada et al., 1993; Mourão Filho et al., 1996), demonstrando que este aspecto pode ser utilizado para comparar o híbrido com seus parentais. No presente trabalho, esta análise foi uma ferramenta essencial para a identificação do híbrido somático entre laranja ‘Hamlin’ + ‘seedling’ de toranja ‘Singapura’, onde o híbrido apresentou morfologia intermediária e bastante diferente de seus parentais (Figura 5b), característica que se torna nítida quando comparada ao autotetraplóide que, por sua vez, apresentou morfologia bastante semelhante à do ‘seedling’ de toranja ‘Singapura’.