A hemotoxicidade in vitro foi avaliada pela percentagem (%) de hemólise de eritrócitos humanos (não parasitados) causada pelos compostos SL4C, SL5C e SL20C num intervalo de concentrações testadas (10 µM a 0,04 µM). Os valores são apresentados na Tabela 5.
Tabela 5 - Percentagem (%) de hemólise de eritrócitos saudáveis in vitro induzida pelos compostos.
PBS (phosphate buffered saline): tampão fosfato salino; RPMIc: meio de cultura de P. falciparum completo; *p-value = 0,04 em comparação com o controlo negativo - PBS.
O meio usado para cultivar P. falciparum in vitro contém vermelho de fenol (apresentando cor rosada), no sentido de avaliar o impacto da cor do meio de cultura nos valores de absorvância, o ensaio de hemólise foi realizado em PBS e RPMIc. Para o ensaio dos compostos, foi adicionado 0,2% de DMSO (correspondente ao solvente dos
% de hemólise
38 compostos). A CQ foi usada como controlo (Tabela 5). Os dados representam a média ± desvio padrão de dois ensaios independentes feitos em triplicado.
Os compostos não apresentaram hemólise significativamente diferente dos controlos negativos - PBS ou RPMIc com 0,2% de DMSO. Os valores de % de hemólise apenas foram significativamente diferentes do controlo negativo por ação da CQ, no limiar de significância p-value = 0,04 e apenas na dose máxima de 10 µM em PBS. A Figura 11 representa graficamente os dados obtidos.
Figura 11 - Percentagem (%) de hemólise de eritrócitos saudáveis in vitro induzida pelos compostos em PBS e RPMIc. As barras de erro representam a média ± desvio padrão da % de hemólise dos compostos relativamente ao controlo positivo (C+) obtida por ação do Triton® X-100. C- : controlo negativo PBS ou RPMIc com 0,2% de DMSO.
39
4. Inibição da polimerização da hemozoína (β-hematina) in vitro dos compostos
A CQ foi usada como controlo positivo no ensaio de inibição da polimerização da β-hematina in vitro. Quanto maior a dose de CQ testada, maior inibição da polimerização da hemina in vitro, menor a quantidade de β-hematina obtida (conforme observado visualmente na Figura 12) e menor a absorvância (Figura 13).
Figura 12 - Ação inibitória da CQ na polimerização de hemozoína (β-hematina) in vitro.
A CQ apresentou uma percentagem (%) de inibição da polimerização de β-hematina na dose máxima testada (37,0 µM) 14,4% superior à da dose intermédia (18,5 µM) e 26,2% superior à menor dose (9,3 µM). A inibição da polimerização da hemozoína (β-hematina) in vitro pelos compostos SL4C, SL5C, SL20C, pela CQ e correspondentes parâmetros da regressão linear ajustada estão representados na Figura 13.
40 Figura 13 - Inibição da polimerização da hemozoína (β-hematina) in vitro pelos compostos SL4C, SL5C, SL20C e da CQ. As barras de erro representam a média ± desvio padrão.
Foram observadas diferenças significativas de inibição da polimerização da β-hematina entre as diferentes concentrações/doses de CQ testadas (37,0 µM, 18,5 µM e 9,3 µM) (51). As diferenças obtidas indicaram um efeito dose-resposta traduzido por uma regressão linear com um declive significativamente diferente de zero (R2 = 0,8186;
p-value = 0,01).
Em relação aos compostos SL4C, SL5C e SL20C, não se observaram diferenças significativas na absorvância entre as doses testadas (48,0 µM, 24,0 µM e 12,0 µM para SL4C e SL5C; 96,0 µM, 48,0 µM e 24,0 µM para SL20C) (Figura 13). Não se observou inibição significativa da polimerização da β-hematina in vitro pelos compostos SL4C, SL5C e SL20C.
V – DISCUSSÃO
42
Atividade anti-malárica in vitro dos compostos na estirpe 3D7 de Plasmodium falciparum
Estes compostos estudados são provenientes de uma subclasse de alcaloides (produtos naturais) da quinazolinona, que possuem uma estrutura química com três anéis, em que dois anéis são caraterísticos da classe de compostos da quinazolinona e o terceiro anel adicional é denominado piperazina. A diferença entre a classe de compostos quinazolinona e a subclasse da quinazolinona testada é o terceiro anel de piperazina adicional e o grupo indol (ver Figura 5) (55).
A quinazolinona é de uma classe quimicamente diferente da quinazolina, nesse sentido, os compostos estudados pertencem a uma nova subclasse de alcaloides da quinazolinona, para a qual não existem estudos sobre atividade anti-malárica in vitro, podendo considerar-se o presente estudo como pioneiro.
O valor de IC50 obtido para a CQ está de acordo com o descrito na literatura, para P. falciparum estirpe 3D7, em ensaios realizados em idênticas condições laboratoriais (64). Assim, este ensaio de determinação de IC50 dos novos compostos pode ser considerado válido.
Os compostos SL4C, SL5C e SL20C apresentaram maior atividade anti-malárica contra P. falciparum estirpe 3D7. Apesar destes compostos terem a mesma estereoquímica, o composto SL5C demonstrou uma maior atividade anti-malárica que o SL4C, uma vez que o valor de IC50 de SL5C é inferior ao valor de SL4C. Na posição C1, o composto SL5C possui um grupo butil e o SL4C possui um grupo propil. Estudos recentes referem que a introdução do grupo R representado por butil aumenta a potência anti-malárica contra P. falciparum estirpe 3D7 (69), enquanto que um composto com um grupo propil demonstrou ser menos eficaz contra o parasita (70), sendo concordante com os resultados obtidos.
O composto SL20C que possui um grupo butil em C1 e dois substituintes halogenados de cloro no anel aromático demonstrou menor atividade anti-malárica, pois apresentou um valor de IC50 superior em relação a SL4C e SL5C. Um estudo recente menciona que substituintes de cloro causaram uma menor atividade anti-malárica, o qual está de acordo com os resultados obtidos (71).
43 Quando um grupo propil ou butil é adicionado em vez de um grupo etil ou metil, a atividade anti-malárica do composto resultante diminui. Assim, sugere-se a alteração dos grupos propil e butil para grupos etil ou metil bem como a modificação dos substituintes halogenados de cloro dos compostos estudados a fim de obter uma maior atividade anti-malárica (70,71).
Os núcleos básicos dos compostos febrifugina 51 e do seu isómero, a isofebrifugina 52 contêm porções de quinazolinonas com potencial atividade anti-malárica. Está descrito que a febrifugina que pertence à mesma família das quinazolinonas possui melhor atividade anti-malárica in vitro de P. falciparum que as quinazolinonas, pois um composto 53 derivado da febrifugina com um átomo de azoto extra na posição 5 ou 6 do anel aromático, demonstrou um valor de IC50 de 1,2 nM para a estirpe de P. falciparum sensível à CQ, apresentando atividade anti-malárica in vitro comparável ao composto 51, enquanto que o composto 54 com difluoreto ligado a C-5 e a C-6 apresentou um valor de IC50 de 0,33 nM para a mesma estirpe, tendo atividade anti-malárica in vitro superior à febrifugina (7,72).
Estudos realizados apresentaram valores de IC50 para a estirpe de P. falciparum sensível à CQ que variam entre 2,8 × 10-9 M e 7,0 × 10-10 M para derivados de febrifugina (44,59,60).
Os restantes compostos exibidos no Anexo III apresentaram uma curva dose-resposta que não é biologicamente viável, o que é sugestivo de serem compostos sem atividade biológica, podendo ser impuros, degradarem-se em cultura ou apresentarem falta de solubilidade do composto.
Citotoxicidade in vitro dos compostos em células de mamífero
Um critério importante na pesquisa de compostos ativos com atividade anti-malárica é a sua citotoxicidade em células hospedeiras de mamíferos. As células utilizadas para o ensaio de citotoxicidade in vitro foram as células de mamífero V79, provenientes da linha celular não tumoral de fibroblastos de pulmão de hamster Chinês (73).
44 Os resultados obtidos demonstraram valores de DL50 e de IS relativamente baixos para os compostos SL4C, SL5C e SL20C. A CQ usada como fármaco anti-malárico de referência neste ensaio apresentou valores de DL50 e de IS elevados (167,00 µM e 11074 respetivamente, Tabela 4) conforme o expetável, pois a CQ é um anti-malárico que apresenta baixa citotoxicidade em células de mamífero. Embora o valor de DL50 em células V79 da CQ tenha sido superior ao descrito (25,85 µM) por outros autores (73), esta diferença pode ser devida às diferentes condições laboratoriais de teste, nomeadamente o tempo de incubação descrito foi de 48h e neste estudo foi de 24h, apesar de usarem o mesmo ensaio (MTT).
Quanto maior for o IS, mais promissor como anti-malárico será o composto, devido à sua ação seletiva contra o parasita P. falciparum (74). Geralmente, um valor de IS ≥ 10 indica que um composto apresenta uma janela terapêutica aceitável no desenvolvimento de fármacos anti-maláricos (68,75,76). Os IS calculados para os compostos SL4C, SL5C e SL20C situam-se entre 19 – 70 (Tabela 4), assim encontram-se dentro do intervalo de encontram-segurança aceitável para prosencontram-seguir o encontram-seu deencontram-senvolvimento e melhoramento como possíveis anti-maláricos. Não obstante, seria necessário realizar mais estudos, nomeadamente ensaios in vivo para considerar estes compostos como sendo seguros.
Os resultados de citotoxicidade obtidos para SL4C, SL5C e SL20C são concordantes com os obtidos para outros alcaloides da quinazolinona em linhas celulares não tumorais como as células Vero (77), AG01523 (78) e HUVSMC (79).
Os resultados preliminares obtidos por Sousa e colaboradores (comunicação pessoal, resultados não publicados) indicam que os compostos SL4C e SL5C têm atividade citotóxica fraca a moderada em células humanas tumorais H460, HCT-15 e MCF-7 numa range de concentrações de 31,19 - 64,71 µM. Estes resultados estão em linha com outros estudos que descrevem a atividade citotóxica de alcaloides da quinazolinona em linhas de células tumorais H460 (80), HCT-15 (81), MCF-7 (77,82), HL-60, K-562 (78), HepG2 (77) e HeLa (81,83).
45
Hemotoxicidade in vitro dos compostos
A hemólise induzida por fármacos sendo relativamente rara, constitui uma ocorrência grave e pode ocorrer por dois mecanismos: hemólise alérgica - toxicidade causada por uma reação imunológica em doentes previamente sensibilizados para um fármaco; hemólise tóxica - toxicidade direta do fármaco, do seu metabolito ou um excipiente na formulação (84). Os fármacos, os seus metabolitos ou excipientes utilizados na formulação podem causar hemólise tóxica, sendo necessário avaliar a atividade hemolítica dos fármacos e dos novos compostos (85). Tratando-se o presente trabalho da seleção e caraterização in vitro de candidatos a fármacos, apenas foi avaliado o possível efeito de hemólise tóxica dos compostos isoladamente. Neste contexto, a hemólise é definida como uma alteração/destruição de eritrócitos que resulta na libertação de hemoglobina para o meio (86). O ensaio de hemólise in vitro avalia a libertação de hemoglobina no meio (como indicador da lise de eritrócitos) após a exposição ao composto em estudo (84).
O ensaio de hemólise in vitro standard descrito na literatura (66) é realizado em PBS (tampão fosfato, isotónico incolor), sendo este usado como controlo negativo.
Neste estudo, a % de hemólise induzida pelos compostos foi também determinada em condições de cultura padrão de P. falciparum, por estas serem mais próximas às condições do sangue humano e por serem também as condições em que foi avaliada a atividade anti-malárica.
Observou-se que os valores de % de hemólise de eritrócitos saudáveis induzida pelos compostos e pela CQ em meio RPMIc variaram entre 5,3 e 6,5% e em PBS entre 2,5 e 3,6%. Em RPMIc, os valores de % de hemólise foram cerca de 2,5% superiores aos obtidos com PBS. Isto pode dever-se ao Triton® X-100 fazer um shift na absorvância, ao ligar-se às proteínas do albumax constituinte do RPMIc, aumentando desta forma a absorvância e consequentemente a % de hemólise (87).
O Triton® X-100, usado como controlo positivo (C+) causou hemólise, conforme o esperado, pois é um detergente hemolítico não iónico conhecido que causa 100% de hemólise à concentração testada (88,89). Como controlo negativo (não hemolítico) foi usado PBS ou RPMIc com 0,2% de DMSO para os compostos, e para
46 testar a CQ foi usado PBS ou RPMIc sem DMSO. Conforme esperado, as soluções de PBS ou RPMIc com ou sem 0,2% de DMSO não causaram hemólise (90).
A CQ também não apresentou atividade hemolítica nas concentrações ≤ 2,5 µM (em concordância com o que está descrito), sendo considerada um fármaco anti-malárico não hemolítico em eritrócitos humanos saudáveis (91). No ensaio com PBS e na dose de 10 µM (Tabela 5), registou-se uma % de hemólise induzida pela CQ significativamente (p-value = 0,04) superior ao controlo negativo com PBS. Porém, a % de hemólise na dose 10 µM fica ainda muito abaixo dos 10-25% (92).
Os compostos SL4C, SL5C e SL20C não apresentaram atividade hemolítica, pois os valores de % de hemólise foram < 10%, valor considerado para a classificação de não hemolítico (92). Valores de % de hemólise > 25% são considerados como indicativos de risco de hemólise (92). Os compostos SL4C, SL5C e SL20C apresentaram valores de % de hemólise em eritrócitos saudáveis ≤ 6,5%, sendo relativamente semelhantes nas diferentes concentrações testadas (10 µM, 2,5 µM, 0,63 µM, 0,16 µM e 0,04 µM) e na range de valores obtidos para os respetivos controlos negativos (PBS ou RPMIc com 0,2% de DMSO) (Figura 11).
Estudos recentes sobre atividade hemolítica de alcaloides da quinazolinona corroboram os resultados obtidos referindo ausência de atividade hemolítica in vitro significativa (valores de hemólise < 4%) para este grupo de compostos (93,94).
Inibição da polimerização da hemozoína (β-hematina) in vitro dos compostos
A CQ usada como fármaco anti-malárico de referência e como controlo positivo para validar este ensaio, inibe significativamente a polimerização da hemozoína (β-hematina) in vitro como seria de esperar, pois a CQ liga-se a porções de hemozoína produzidas a partir de hemoglobina processada proteoliticamente dentro de eritrócitos infetados, interferindo assim com a desintoxicação da hemozoína (3), ou seja, a CQ liga-se à hematina (ou ferriprotoporfirina IX(FeIII), FPIX) para formar um complexo FPIX-CQ que é altamente tóxico para o parasita (50,51,53). A capacidade da CQ para inibir a polimerização da hemozoína está diretamente relacionada com a sua potência anti-malárica. A CQ inibe a polimerização in vivo dos grupos heme (impedindo a
47 formação da hemozoína) bem como a polimerização in vitro da hemina impedindo a produção de β-hematina (hemozoína sintética) (51).
Os compostos SL4C, SL5C e SL20C não inibiram significativamente a polimerização da β-hematina in vitro.
A febrifugina inibe significativamente a formação de hemozoína necessária para a maturação do parasita Plasmodium spp. no estadio de trofozoíto (37,41,61). Assim, os resultados obtidos não vão de encontro com o que está descrito na literatura, pois as quinazolinonas são globalmente da mesma família da febrifugina, apesar de serem de uma classe diferente quimicamente (7,55), sendo expetável que os compostos alcaloides da quinazolinona estudados apresentassem o idêntico mecanismo de ação da febrifugina.
De acordo com a literatura, algumas classes da quinazolinona inibem a polimerização da β-hematina in vitro (95), não sendo concordante com os resultados obtidos.
VI – CONCLUSÃO
49 Dos 18 alcaloides da quinazolinona estudados, foram selecionados para estudos adicionais os compostos SL4C, SL5C e SL20C, na medida em que demonstraram uma boa atividade anti-malárica in vitro (IC50 ≤ 0,2 µM) na estirpe 3D7 de P. falciparum.
Os compostos não revelaram ser citotóxicos in vitro em células de mamífero não tumorais V79 (DL50 ≤ 14 µM), com um valor de IS ≥ 19.
Estes compostos não apresentaram atividade hemolítica significativa em eritrócitos humanos saudáveis.
Não foi detetada a inibição da polimerização da hemozoína (β-hematina) in vitro dos compostos nas doses testadas.
As quinazolinonas SL4C, SL5C e SL20C possuem caraterísticas com potencial para o desenvolvimento como novos fármacos anti-maláricos.
Assim, sugere-se estudos adicionais in vitro tanto para a compreensão do mecanismo de ação intrínseco a esta subclasse, como para a síntese de novos possíveis compostos com alterações na estrutura química original desta subclasse de quinazolinonas, ou ainda sintetizar novos possíveis compostos híbridos de quinazolinonas e fármacos com elevada atividade anti-malárica contra P. falciparum (ex. artemisininas), uma vez que estudos recentes valorizam os compostos híbridos como promissores fármacos anti-maláricos da próxima geração (96).
Em suma, uma investigação futura da estrutura química das quinazolinonas poderia dar resultados mais esperançosos na área da química medicinal.
VII – BIBLIOGRAFIA
51
Bibliografia
1. WHO. World Malaria Report 2017. Geneva World Heal Organ. 2017;196.
2. Cowman AF, Crabb BS. Invasion of red blood cells by malaria parasites. Cell. Plasmodium intabazwe n. sp. (Apicomplexa: Haemospororida: Plasmodiidae) in the Afromontane Pseudocordylus melanotus (Sauria: Cordylidae) with a review of African saurian malaria parasites. Parasites and Vectors. 2016;9(1).
5. Chagas CRF, Valkiūnas G, De Oliveira Guimarães L, Monteiro EF, Guida FJV, Simões RF, et al. Diversity and distribution of avian malaria and related haemosporidian parasites in captive birds from a Brazilian megalopolis. Malar J.
2017;16(1):1–20. Discovery : a Technology Driven Approach To Combating Malaria. :1–7.
10. Nogueira F, Rosário VE do. Methods for assessment of antimalarial activity in the different phases of the Plasmodium life cycle. Rev Pan-Amazônica Saúde.
52 2010;1(3):109–24.
11. Despommier, Gwadz, Hotez, Knirsch. Parasitic Diseases. Parasitic Diseases.
2005. 20 p.
12. Tuteja R. Malaria - An overview. FEBS J. 2007;274(18):4670–9.
13. Pradel G, Schlitzer M. Antibiotics in Malaria Therapy and their Effect on the Parasite Apicoplast. Curr Mol Med. 2010;10(3):335–49.
14. WHO. Guidelines for treatment of malaria, Third Edition. World Heal Organ.
2015;71–88.
15. Calderaro A, Piccolo G, Gorrini C, Rossi S, Montecchini S, Dell’Anna ML, et al.
Accurate identification of the six human Plasmodium spp. causing imported malaria, including Plasmodium ovale wallikeri and Plasmodium knowlesi. Malar J. 2013;12(1):1–6.
16. Fu Y, Tilley L, Kenny S, Klonis N. Dual labeling with a far red probe permits analysis of growth and oxidative stress in P. falciparum-infected erythrocytes.
Cytom Part A. 2010;77(3):253–63.
17. Wiley J, & Sons. Severe malaria. Trop Med Int Heal. 2014;19(1):7–131.
18. Breman JG, Campbell CC. Combating severe malaria in African children. Bull World Health Organ. 1988;66(5):611–20.
19. Guyatt HL, Snow RWR. Impact of malaria during pregnancy on low birth weight in sub-Saharan Africa. Clin Microbiol Rev. 2004;17(4):760–9.
20. Murray CJL, Rosenfeld LC, Lim SS, Andrews KG, Foreman KJ, Haring D, et al.
Global malaria mortality between 1980 and 2010: A systematic analysis. Lancet.
2012;379(9814):413–31.
21. Nayyar GML, Breman JG, Newton PN, Herrington J. Poor-quality antimalarial drugs in southeast Asia and sub-Saharan Africa. Lancet Infect Dis.
2012;12(6):488–96.
53 22. WHO. World Malaria Report 2016. Geneva: World Health Organization. 2016.
1-186 p.
23. Hovlid ML, Winzeler EA. Phenotypic Screens in Antimalarial Drug Discovery.
Trends Parasitol. 2016;32(9):697–707.
24. CDC. Malaria Biology. https://www.cdc.gov/malaria/about/biology/. 2016.
25. Aly ASI, Vaughan AM, Kappe SHI. Malaria Parasite Development in the Mosquito and Infection of the Mammalian Host. Annu Rev Microbiol.
2009;63:195–221.
26. Silvie O, Mota MM, Matuschewski K, Prudêncio M. Interactions of the malaria parasite and its mammalian host. Curr Opin Microbiol. 2008;11(4):352–9.
27. Delves M, Plouffe D, Scheurer C, Meister S, Wittlin S, Winzeler EA, et al. The activities of current antimalarial drugs on the life cycle stages of plasmodium: A comparative study with human and rodent parasites. PLoS Med. 2012;9(2).
28. WHO. Date Accessed. Malaria Vaccine Rainbow Tables.
http://www.who.int/vaccine_research/links/Rainbow/en/index.html. 2017.
29. Arav-Boger R, Shapiro TA. MOLECULAR MECHANISMS OF RESISTANCE IN ANTIMALARIAL CHEMOTHERAPY: The Unmet Challenge. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2005;45:565–85.
30. Cowman AF, Foote SJ. Chemotherapy and drug resistance in malaria. Int J Parasitol. 1990;20(4):503–13.
31. Butler AR, Khan S, Ferguson E. A brief history of malaria chemotherapy. J R Coll Physicians Edinb. 2010;40(2):172–7.
32. Talisuna AO, Bloland P, D’Alessandro U. History, dynamics, and public health importance of malaria parasite resistance. ClinMicrobiolRev. 2004;17(1):235–54.
33. WHO. Guidelines for the treatment of malaria, Second edition. WHO. 2010;1–
210.
54 34. WHO. Global report on antimalarial drug efficacy and drug resistance:
2000-2010. Geneva World Heal Organ. 2010;1–121.
35. Wongsrichanalai C, Pickard AL, Wernsdorfer WH, Meshnick SR. Epidemiology of drug-resistant malaria. Lancet Infect Dis. 2002;2(4):209–18.
36. Nogueira F. Slides das aulas de “Malaria Drug Resistance.” Unidade Curric Parasitol Mol. 2017;
37. He D, Wang M, Zhao S, Shu Y, Zeng H, Xiao C, et al. Pharmaceutical prospects of naturally occurring quinazolinone and its derivatives. Fitoterapia.
2017;119(May):136–49.
38. Wellems TE, Plowe C V. Chloroquine-Resistant Malaria. J Infect Dis.
2001;184(6):770–6.
39. WHO. Communicable diseases 2002: global defence against the infectious disease threat. Geneva World Heal Organ. 2003;
40. Petersen I, Eastman R, Lanzer M. Drug-resistant malaria: Molecular mechanisms and implications for public health. FEBS Lett. 2011;585(11):1551–62.
41. Zhu S, Zhang Q, Gudise C, Wei L, Smith E, Zeng Y. Synthesis and biological evaluation of febrifugine analogues as potential antimalarial agents. Bioorganic Med Chem. 2009;17(13):4496–502.
42. WHO. Antimalarial drug combination therapy. Report of a WHO technical consultation. Geneva, World Heal Organ. 2001;
43. Carlton J. Malaria parasite evolution in a test tube. Science (80- ).
2018;359(6372):159–60.
44. Takaya Y, Tasaka H, Chiba T, Uwai K, Tanitsu MA, Kim HS, et al. New type of febrifugine analogues, bearing a quinolizidine moiety, show potent antimalarial activity against Plasmodium malaria parasite. J Med Chem. 1999;42(16):3163–6.
45. Le Bras J, Durand R. The mechanisms of resistance to antimalarial drugs in Plasmodium falciparum. Fundam Clin Pharmacol. 2003;17(2):147–53.
55 46. Zhu S, Chandrashekar G, Meng L, Robinson K, Chatterji D. Febrifugine analogue compounds: Synthesis and antimalarial evaluation. Bioorganic Med Chem. 2012;20(2):927–32.
Antimalarial versus cytotoxic properties of dual drugs derived from 4-aminoquinolines and mannich bases: Interaction with DNA. J Med Chem.
2010;53(8):3214–26.
51. Basilico N, Pagani E, Monti D, Olliaro P, Taramelli D. A microtitre-based method for measuring the haem polymerization inhibitory activity (HPIA) of antimalarial drugs. J Antimicrob Chemother. 1998;42(1):55–60.
52. Pandey A V., Tekwani BL, Singh RL, Chauhan VS. Artemisinin, an endoperoxide antimalarial, disrupts the hemoglobin catabolism and heme detoxification systems in malarial parasite. J Biol Chem. 1999;274(27):19383–8.
53. Tekwani BL, Walker LA. Targeting the Hemozoin Synthesis Pathway for New Antimalarial Drug Discovery : Technologies for In Vitro β -Hematin Formation Assay. Comb Chem High Throughput Screen. 2005;8(1):63–79.
54. Sinha S, Sarma P, Sehgal R, Medhi B. Development in assay methods for in vitro antimalarial drug efficacy testing: A systematic review. Front Pharmacol.
54. Sinha S, Sarma P, Sehgal R, Medhi B. Development in assay methods for in vitro antimalarial drug efficacy testing: A systematic review. Front Pharmacol.