5.3.1 Clonagem, coexpressão e purificação do heterodímero
As sequências codificantes das proteínas SEPT7NGc e SEPT12G foram subclonadas no vetor de expressão bicistrônico pETDuet-1, que possui dois sítios de múltipla clonagem. A SEPT7NGc foi inserida no primeiro sítio, de forma que fosse expressa fusionada à His-tag. Após a confirmação da clonagem por meio da análise de restrição, Figura 47, experimentos de expressão foram realizados e resultaram na obtenção de ambas as proteínas na fração solúvel. A banda referente ao plasmídeo pETDuet-1 SEPT7NGc tem tamanho de, aproximadamente, 6503 pb, enquanto a banda referente à SEPT12G está localizada em, aproximadamente, 822 pb.
95 Figura 47 - Análise de restrição. Subclonagem da SEPT12G no plasmídeo pETDuet-1 SEPT7NGc. No gel está representado: M) marcador 1 kb DNA Ladder (Promega), 1) produtos da digestão.
Fonte: Elaborada pela autora.
Utilizando-se a cromatografia de afinidade foi possível determinar se as proteínas interagiam, uma vez que como apenas a proteína SEPT7NGc estava fusionada à His-tag, a purificação da SEPT12G só seria possível se elas interagissem. Primeiramente, realizou-se a purificação utilizando-se um tampão com 500 mM de NaCl e, como podemos observar na Figura 48A, embora houvesse a expressão de ambas as proteínas, a SEPT7NGc era obtida com excesso em relação à SEPT12G. Em seguida, realizou-se o mesmo experimento alterando apenas a concentração de NaCl para 300 mM e observou-se que ambas as proteínas eram obtidas após eluição e as bandas visualizadas pareciam ser mais equimolares no gel, conforme observado na Figura 48B.
96 Figura 48 - Análise da purificação do complexo formado pelas proteínas SEPT7NGc e SEPT12G em SDS-PAGE 12 %. A) Purificação utilizando o tampão contendo 500 mM de NaCl; B) Tampão contendo 300 mM de NaCl. Nos géis estão representados: M) o marcador de baixo peso molecular; 1) alíquota antes da indução; 2) alíquota após a indução; 3) sobrenadante após lise; 4) pellet; 5) fração não ligada; 6) lavagem 1; 7) lavagem 2; 8) eluição.
A) B)
Fonte: Elaborada pela autora.
A cromatografia de exclusão molecular foi realizada com o objetivo de avaliar o estado oligomérico da amostra e calcular a massa molecular do complexo. No cromatograma mostrado na Figura 49A, foram observados quatro picos e, desta forma, alíquotas foram retiradas para avaliar as massas correspondentes, conforme ilustrado na Figura 49C. As seis primeiras bandas no SDS- PAGE 12 % são correspondentes aos picos um e dois, respectivamente. Elas apresentaram apenas a banda de tamanho compatível com a proteína SEPT7NGc (aproximadamente 41,7 kDa), que pode estar interagindo entre si, formando um agregado de alta massa molecular. Em seguida, as bandas denominadas de 3 apresentam ambas as proteínas em concentrações aproximadamente equimolares, sendo assim considerada a fração de interesse. Por fim, as bandas denominadas de 4 apresentaram excesso de SEPT7NGc, provavelmente monomérica, e, assim, foram descartadas.
97 Figura 49 - Purificação do complexo em cromatografia de exclusão molecular. A) Perfil cromatográfico; B) Curva de calibração em coluna Superdex200; C) SDS-PAGE 12 % correspondente aos picos eluídos em A: M) marcador de massa molecular; 1) pico 1; 2) pico 2; 3) pico 3 e 4) pico 4. A) B) 5 10 15 20 0.0 0.2 0.4 4 3 1 Absor bâ nc ia280nm (u.a .) volume (mL) 2 1.6 2.4 3.2 0.30 0.45 0.60 Ferritina Aldolase Conalbumina Ovalbumina Anidrase Carbônica Ribonuclease A K AV log10MM y = 0.854 - 0.244x C)
Fonte: Elaborada pela autora.
Para determinar a massa molecular aparente da fração que apresenta ambas as proteínas foram realizadas duas corridas cromatográficas contendo os padrões de massa moleculares. Construiu-se uma curva de calibração, ilustrada na Figura 49B, cuja reta que melhor ajustava os pontos é descrita pela equação: y = 0,854 – 0,244x. O valor de KAV obtido para o complexo SEPT7NGc-SEPT12G foi de 0,30 e, por interpolação deste valor na equação da reta, obteve-se que a massa molecular aparente do complexo foi de 184,6 kDa.
O valor esperado para um dímero das proteínas que apresentam massa molecular teórica de 31,7 kDa para a SEPT12G e 41,7 kDa para a SEPT7NGc seria de, aproximadamente, 73,4 kDa.
98 No entanto, foi estimado uma massa molecular aparente de 184,6 kDa que pode indicar a formação de um complexo que provavelmente é um tetrâmero. Esta espécie pode ter sido formada pela interação promíscua entre o C-terminal da SEPT7NGc. Além disso, a obtenção da massa molecular esperada para uma proteína por cromatografia de exclusão molecular tem como desvantagem desvios causados pelos diferentes raios hidrodinâmicos. Estes podem variar tanto devido ao tamanho da proteína, quanto devido à forma desta. Um tetrâmero teria uma forma bastante alongada, que aumentaria o volume hidrodinâmico observado. Para determinar com precisão a massa molecular aparente desta espécie deverão ser realizados ensaios utilizando a técnica de SEC- MALS.
5.3.2 Análise do estado oligomérico por cromatografia de exclusão molecular acoplada a análise da dispersão de luz em vários ângulos (SEC-MALS)
Amostras do heterodímero SEPT7NGc-SEPT12 foram submetidas à cromatografia de exclusão por tamanho molecular. Em seguida, as alíquotas obtidas na eluição foram concentradas até 2,3 mg/mL. Estas amostras foram aplicadas em uma coluna Superdex200 analítica com o objetivo de determinar a massa molecular com maior precisão. Os perfis cromatográficos observados estão ilustrados na Figura 50.
Figura 50 - Dispersividade das amostras do heterodímero SEPT7NGc-SEPT12G analisadas pelo método de SEC-MALS. A curva em azul corresponde à leitura do espalhamento de luz a 90º (LS), em vermelho refere-se ao sinal do índice de refração diferencial (dRI) e o sinal em preto refere-se à distribuição de massa molecular para os picos obtidos. Em destaque encontra-se o gráfico do sinal obtido para o dRI versus o tempo, ampliado para melhor visualização.
99 Foram realizadas três medidas e, como podemos observar na Figura 50, dois picos foram obtidos, nos volumes de eluição iguais a 3,6 e 6,2 mL. Estes foram chamados de pico 1 e 2, respectivamente e os parâmetros obtidos para cada amostra e a média estão descritos na Tabela 13. O pico 1 apresentou alta massa molecular, igual a 22355,7 ± 20130,3 kDa, e polidispersividade de 1,329 ± 0,184, sugerindo tratar-se de um agregado. O pico 2 apresentou massa molecular igual a 72,36 ± 4,53 kDa e polidispersividade de 1,000 ± 0,00. Uma vez que a massa esperada para o heterodímero é de 75,7 kDa, os resultados sugerem que o heterodímero foi formado na condição utilizada e trata-se de uma espécie monodispersa. Os valores da massa de cada pico mostra que embora o agregado estivesse presente, a concentração deste na amostra é muito pequena.
Tabela 13 - Parâmetros obtidos para a análise de SEC-MALS do heterodímero SEPT7NGc- SEPT12G. Pico 1 Pico 2 Amostra Mw (kDa) Polidispersividade Massa (𝜇g) Mw (kDa) Polidispersividade Massa (𝜇g) 1 7175,29 (±3,7%) 1,226 (±5,5%) 0,63 68,32 (±0,91%) 1,001 (±1,272%) 11,37 2 45190,30 (±4,8%) 1,541 (±9,2%) 0,63 77,26