4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.8 Hidrólise enzimática de celulignina parcialmente deslignificada (CPD)
4.8.1 Efeito do grau de deslignificação da celulignina
A fim de avaliar o efeito do grau de deslignificação da celulignina parcialmente deslignificada no desempenho hidrolítico do preparado celulásico produzido por T. harzianum IOC 3844, foram preparadas amostras de celulignina com diferentes graus de deslignificação. Inicialmente o bagaço de cana de açúcar foi pré-tratado utilizando ácido sulfúrico 1% para retirar a hemicelulose. Em seguida foram preparadas diferentes amostras de celulignina com diferentes graus de deslignificação utilizando solução de NaOH com diferentes concentrações: 0,10%; 0,25%; 0,50%; 1%; 2% e 4%. Foi feito experimento controle utilizando-se bagaço de cana sem pré-tratamento.
A hidrólise utilizando o preparado celulásico de T. harzianum foi realizada com carga enzimática normalizada em 25 FPU/g de CPD. A concentração de CPD (para cada grau de deslignificação) foi de 100 g/L. Os experimentos foram conduzidos em duplicata em frascos Erlenmeyers previamente identificados, contendo 200 mL de meio reacional (tampão citrato de sódio 0,05 M pH 5, enzima e CPD), a 50oC sob agitação de 200 rpm por 72 horas. Os perfis cinéticos das hidrólises foram obtidos com amostragens de 1 mL a cada três horas durante as primeiras 12 horas, e posteriormente foram feitas amostragens em intervalos maiores. As amostras foram centrifugadas a 10.000 rpm a 10°C durante 10 minutos e o sobrenadante armazenado a -20°C até a análise das amostras. Do sobrenadante foi feita a quantificação de glicose e açúcares redutores liberados.
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4.8.2 Comparação com um preparado celulásico comercial e efeito da adição ĚĞɴ-glucosidase
O desempenho do preparado enzimático concentrado de T. harzianum (Ladebio Th) foi comparado com a preparação enzimática Multifect® produzido pela Genencor, ambos com adição de ɴ-glucosidase comercial (NS 50010).
Os experimentos de hidrólise foram conduzidos com uma carga enzimática normalizada de 25 FPU/g, na proporção de 1 FPU: 5 BG (ɴ -glucosidase), e uma concentração de substrato de 100 g/L de celulignina parcialmente deslignificada pré-tratada como descrito no item 4.1. Os experimentos foram realizados em triplicata em frascos Erlenmeyers com 200 mL de meio reacional (tampão citrato de sódio 0,05 M pH 5, enzima e CPD), a 50°C, agitação de 200 rpm durante 24 horas. Durante este procedimento, alíquotas foram periodicamente obtidas para avaliação do perfil cinético. As amostras foram centrifugadas a 10.000 rpm a 10 °C durante 10 minutos e o sobrenadante armazenado a -20°C até a análise das amostras. Do sobrenadante foi feita a quantificação de glicose liberada.
4.8.3 Avaliação de diferentes concentrações de substrato e diferentes cargas enzimáticas
Com intuito de verificar o efeito da carga enzimática e da concentração de substrato na performance do preparado celulásico de T. harzianum, foram feitos diferentes experimentos de hidrólise enzimática de celulignina parcialmente deslignificada. Os experimentos foram realizados de acordo com a tabela 4.3, de modo que para cada concentração de substrato (25 g/L, 50 g/L, ou 100 g/L) foram avaliadas três cargas enzimáticas (25 FPU/g, 50 FPU/g, ou 75
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FPU/g). Um experimento controle foi feito sem enzima nas mesmas condições que as amostras. A celulignina parcialmente deslignificada (CPD) foi pré-tratada como descrito no item 4.1.
Os experimentos foram realizados em triplicata, em frascos cônicos com 100 mL de meio reacional (tampão citrato de sódio 0,05 M pH 5, enzima e CPD), a 50°C, sob agitação de 200 rpm durante 48 horas, utilizando celulignina parcialmente deslignificada como fonte de celulose. Durante este procedimento, alíquotas foram periodicamente retiradas para a elaboração de um perfil cinético. As amostras foram centrifugadas a 10000 rpm durante 10 min e o sobrenadante armazenado a -20°C até a análise das amostras. Do sobrenadante foi feita a quantificação de glicose e celobiose liberadas.
Tabela 4.3. Concentrações de CPD e cargas enzimáticas (preparado enzimático de T.
harzianum) utilizadas na hidrólise enzimática.
Concentração de Carga enzimática
CPD (g/L) (FPU/g)
25
25 50
75
25
50 50
75
25
100 50
75
Como exemplo, a figura 4.6 mostra o aspecto do bagaço de cana após a hidrólise enzimática utilizando o preparado enzimático de T. harzianum. A fotografia refere-se à amostra de 100 g/L e 75 FPU/g.
92 Figura 4.6. Aspecto do bagaço de cana após a hidrólise enzimática utilizando o preparado enzimático de T. harzianum.
A eficiência de hidrólise dos distintos ensaios foi calculado com base na presença de 68% de celulose na CPD (dados mostrados na seção de resultados), de acordo com a seguinte equação:
Eficiência de hidrólise (%) = . glicose liberada (g.L-1) x 100 concentração de CPD x 0,68 x 1,1
Onde:
0,68 é o teor de celulose na celulignina (g/g); e
1,1 é um fator estequiométrico que representa a adição de moléculas de água aos resíduos de anidroglicose em celulose.
A análise estatística foi realizada com objetivo de determinar a significância dos parâmetros avaliados na hidrólise enzimática utilizando celulases de T. harzianum: concentração de substrato (25, 50 e 100 g/L), carga enzimática (25, 50 e 75 FPU/g) e tempo (0, 3, 6, 9, 12, 24 e 48 horas) em um
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delineamento fatorial 3x3x7 e Teste de Tukey para comparação de médias.
Estas análises foram realizadas para um nível de confiança de 95% (nível de significância de 5%), utilizando o programa STAT versão 2.0 (FCAV / UNESP, Software Jaboticabal). A eficiência de hidrólise e a concentração de glicose liberada foram as variáveis de resposta.
4.8.4 Quantificação em HPLC dos açúcares produzidos
As amostras dos hidrolisados foram centrifugadas a 12.000 rpm por 20 min a 10oC. Em seguida o sobrenadante foi filtrado em membrana Millex 4 mm de diâmetro e porosidade 0,22 µm (Millipore). Posteriormente as amostras foram adequadamente diluídas e analisadas por HPLC.
Os açúcares produzidos na hidrólise enzimática (glicose e celobiose) foram quantificados por sistema de cromatografia líquida de alta performance (HPLC) (Waters 2414, detector de índice de refração, coluna HPX87P). A temperatura do detector foi 40oC, e a da coluna 80oC. A fase móvel foi água milliQ, a um fluxo de 0,6 mL/min. Como padrões foram utilizadas glicose e celobiose.
4.8.5 Quantificação dos açúcares redutores
A quantificação dos açúcares redutores foi realizada em microtubos eppendorf de 2 mL, incubando-se 100 µL de amostra (devidamente diluída) com 300 µL de reagente de DNS. A reação ocorreu por 5 min a 100 oC. Após este período, foram adicionados 1,5 mL de água, seguido de homogeneização em vórtex. A intensidade da cor formada foi quantificada em espectrofotômetro a 540 nm (MILLER, 1959).
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