Hidrólise enzimática

Para que os açúcares presentes no material lignocelulósico sejam fermentados, é necessária a etapa de hidrólise dos polímeros de carboidratos, realizada por um grupo de enzimas (celulases) que atuam sinergicamente (i.e. de forma cooperativa) (WALKER; WILSON, 1991). O mecanismo amplamente aceito para a hidrólise enzimática da celulose envolve ações sinergísticas entre, pelo menos, três grupos maiores de celulases: (1) endoglucanases (EG, endo-1,4-D-glucanohydrolase ou EC 3.2.1.4.), que, randomicamente, atacam regiões de baixa cristalinidade da fibra de celulose, criando extremidades de cadeia livres; (2) exoglucanase ou celobiohidrolase (CBH, 1,4-β-D-glucan cellobiodehydrolase ou EC 3.2.1.91.), que remove unidades de celobiose a partir das extremidades livres; (3) β- Glicosidase (EC 3.2.1.21.), que hidrolisa a celobiose para produzir glicose. Os micro- organismos mais utilizados para a produção comercial de enzimas são os fungos filamentosos do gênero Trichoderma e Aspergillus. Estes fungos produzem um amplo espectro de enzimas, incluindo endoglucanases, exoglucanases, além de complexo de hemicelulases (endo-1,4-β-ᴅ-xilanases, 1,4-β-ᴅ-xilosidases, endo-1,4-β-ᴅ-mananases, 1,4- β-ᴅ-manosidases, α-ᴅ-galactosidases, α-l-arabinofuranosidases, α-glucuronidases, acetil xilana esterases, e feruloil e ácido p-cumárico esterases) e outras enzimas acessórias, como as glicosídeo hidrolases pertencentes às famílias 9, 48 e 61 que são essenciais para a hidrólise da biomassa lignocelulósica. Estas enzimas atuam sinergisticamente para clivar as ligações da tanto da celulose quanto da hemicelulose (AGRAWAL et al., 2015; BERLIN et al., 2005).

Atualmente, as empresas produtoras de enzimas como a Novozymes (Cellic CTec 2 e 3), DuPont-Genencor (Accelerase 1500, XP, XC, BG e Duet) e Dyadic International (AlternaFuel CMAX, Dyadic CMAX) produzem preparações multi-enzimáticas para a obtenção de açúcares fermentescíveis de maneira mais eficiente. Algumas destas preparações enzimáticas mais avançadas contém altos teores de β-glicosidase e de proteínas pertencentes à classe das mono-oxigenases líticas de polissacarídeos (LPMO, do inglês lytic polysaccharide monooxygenases), que as torna menos susceptíveis à inibição pelo produto final, melhorando, assim, a performance global destes coquetéis enzimáticos (CANNELLA; JØRGENSEN, 2014).

As LPMO’s que, no advento da sua descoberta, haviam sido classificadas como pertencentes à família GH61 (glicosil-hidrolase), foram reclassificadas e atualmente são denominadas AA9 (auxiliary activity) por possuírem ação oxidante ao invés de hidrolítica

(LEVASSEUR et al., 2013). Esta enzima cliva as ligações intermoleculares da cadeia de glucana ao oxidarem os carbonos C1 e/ou C4, gerando um terminal não oxidado (redutor ou não redutor, dependendo do mecanismo da AA9) e um terminal com um resíduo oxidado, denominado ácido aldônico. Assim, esta classe de enzima cria sítios de reação para as celobiohidrolases de uma forma completamente diferente, uma vez que, aparentemente, as LPMO’s não necessitam de um sítio de ligação específico e, portanto, possuem potencial para romper mesmo a celulose cristalina (DIMAROGONA; TOPAKAS; CHRISTAKOPOULOS, 2012; HORN et al., 2012). No entanto, para agirem de maneira apropriada, as LPMO’s necessitam de outras moléculas doadoras de elétrons, que podem ser adicionados externamente (como ácido ascórbico ou glutationa), ou até mesmo compostos fenólicos solúveis e a própria lignina presente na matriz lignocelulósica (HORN et al., 2012; MÜLLER et al., 2015). A elucidação dos mecanismos envolvidos nas reações das LPMO’s e a determinação de aspectos estruturais destas enzimas têm sido recentemente explorados com o objetivo de melhorar ainda mais a sua eficiência catalítica (FRANDSEN et al., 2016; FROMMHAGEN et al., 2016). A Figura 10 apresenta uma representação esquemática da ação sinergísticas das cellulases, incluindo as LPMO’s. Recentemente, Beeson et al., 2015) propuseram a classificação das LPMO’s em três tipos, com base na habilidade em oxidar os terminais redutores ou não redutores da cadeia de glucana. De acordo com esta classificação, a LPMO tipo 1 oxida o carbono C1, a tipo 2 o carbono C4 e a tipo 3 oxida ambos, C1 e C4.

Figura 10 - Esquema representativo da despolimerização da celulose pela ação das enzimas hidrolíticas e oxidativas. Abreviações: LPMO = mono-oxigenase lítica de polissacarídeo, CBH = celobiohidrolase.

Fonte: Adaptado de Beeson et al. (2015)

A hidrólise enzimática da celulose é um fenômeno de superfície em que deve ocorrer um contato físico direto entre as enzimas e o substrato (ARANTES; SADDLER, 2011) e é conduzida usualmente em condições brandas de pH (4,8) e temperatura (45 a 50 °C), com a

vantagem de não promover corrosão do reator, quando comparada ao processo de hidrólise ácida (PRASAD; SINGH; JOSHI, 2007). Muitos são os fatores que afetam a hidrólise enzimática da biomassa lignocelulósica, mas pode-se dividi-los em dois grupos: os relacionados às características estruturais do material (devido à estrutura física e composição química) e aqueles relacionados aos mecanismos de ação e interações das enzimas celulolíticas. Dentre estes, as características estruturais do material são os principais fatores limitantes da hidrólise enzimática da celulose, incluindo os conteúdos de lignina, hemicelulose, grupo acetil e proteínas da parede celular, o grau de cristalinidade e polimerização da celulose, o volume dos poros e a superfície acessível (ZHAO; ZHANG; LIU, 2012). Para superar essas limitações físicas, os pré-tratamentos da biomassa, como já mencionados, são requeridos para obter uma hidrólise eficiente do material.

Segundo Rollin et al. (2011), o aumento da acessibilidade da celulose é mais importante do que a deslignificação do material. Estes autores demonstraram que altos níveis de deslignificação da gramínea Panicum virgatum (após o pré-tratamento com amônia), não resultaram em maior digestibilidade da celulose, uma vez que não ocorreu aumento da acessibilidade. Já o pré-tratamento do mesmo material com solventes orgânicos e inorgânicos (os quais promovem o rompimento das ligações de hidrogênio que mantêm as fibras de celulose ordenadas, sem remoção da lignina), tornou a celulose mais acessível, e resultou em maior digestibilidade mesmo com menores cargas de enzimas.

De acordo com Jørgensen, Kristensen e Felby (2007), outros fatores também são conhecidos por inibir a atividade das celulases, como, por exemplo, os produtos derivados da lignina (vanilina, siringaldeído, além dos ácidos ferúlico, p-cumárico e siríngico) e da degradação açúcares (hidroximetilfurfural, furfural e ácido fórmico), que podem ser formados durante a etapa de pré-tratamento. Os efeitos destes compostos sobre a atividade de celulases e hemicelulases foram estudados por Panagioutou e Olsson (2007). Os autores concluíram que as celulases foram significativamente inibidas apenas pelo ácido fórmico, enquanto as hemicelulases foram inibidas não só por este ácido, mas também pelos ácidos vanílico e siríngico, além do siringaldeído. Entretanto, este efeito inibitório pode ser contornado com a lavagem do material pré-tratado para a remoção destes compostos. Por exemplo, Tengborg, Galbe e Zacchi (2001), trabalhando com uma madeira do grupo das coníferas (Picea abies), pré-tratada com vapor catalizado por SO2, reportaram um aumento de aproximadamente 30 % no rendimento de hidrólise enzimática do material lavado em relação à conversão enzimática obtida com o material não lavado.