Hidrólise

O primeiro passo da degradação anaeróbia, consiste na hidrólise ou liquefação dos biopolímeros, por meio de enzimas extracelulares, dado que as bactérias não têm capacidade para assimilar material orgânico na forma particulada. É normalmente um processo lento,

1 2 4 5 6 ₇ 3

sendo os lípidos, no caso geral, hidrolisados mais lentamente, que as outras macromoléculas (HENZE E HARREMÕES, 1983).

A velocidade da hidrólise é afectada por um grande número de factores, entre os quais a superfície específica e varia com o tipo de substrato (EASTMAN E FERGUSON, 1981). Embora no caso de um substrato complexo e heterogéneo a cinética de hidrólise possa ser considerada de 1ª ordem, outras cinéticas podem descrever mais adequadamente a hidrólise de substratos simples e homogéneos (GUJER E ZEHNDER, 1983, EASTMAN E FERGUSON, 1981, VALENTINI

et al., 1997). No caso de substratos complexos esta etapa pode limitar a velocidade do

processo de degradação anaeróbia (PARKIN E OWEN, 1986).

2.1.2.2 Fermentação

Tal como indicado no esquema da Figura 2.1, os substratos utilizados no processo fermentativo, são os monómeros resultantes da hidrólise que, após serem transportados através da membrana celular para o interior da célula, são transformados numa variedade de produtos entre os quais acetato, propionato e butirato.

No geral, a população fermentativa representa cerca de 90% da população bacteriana total dos digestores anaeróbios (ZEIKUS, 1980). O número e a diversidade das espécies bacterianas fermentativas envolvidas no processo depende largamente da composição do substrato e o comportamento da fase acidogénica afecta a metanogénese (BRITZ et al., 1994). Estudos microbiológicos da população fermentativa (ou acidogénica) em digestores anaeróbios, mostraram que a maioria das bactérias fermentativas são anaeróbias obrigatórias sendo algumas anaeróbias facultativas, tais como Streptococci e Enterococcaceae. (MAH E SUSSMAN, 1968). Estas últimas permitem manter o potencial redox do meio em níveis baixos, consumindo o oxigénio que eventualmente possa entrar no digestor, dissolvido no efluente a tratar. WOLIN (1974) observou que o hidrogénio tem um papel preponderante na distribuição dos produtos desta fase do processo. Quando a pressão parcial de hidrogénio é inferior a 10-4 atm forma-se preferencialmente acetato e hidrogénio, segundo a reacção (2.1), sendo este o percurso metabólico mais rentável em termos energéticos (MOSEY E

FERNANDES, 1984).

C6H12O6 + 2H2O → 2CH3COOH + 2CO2 + 4H2 (2.1)

obtendo-se 4 moles de ATP por mole de glucose transformada. Se a pressão parcial de hidrogénio na fase gasosa exceder 10-4 atm, são possíveis duas respostas, no sentido de contrariar o aumento da concentração de hidrogénio:

• produção de butirato, formando apenas 2 moles de hidrogénio / mole de glucose

C6H12O6→ _{CH3CH2CH2COOH + 2CO2 + 2H2 (2.2)}

• produção de propionato, consumindo 2 moles de hidrogénio / mole de glucose

C6H12O6 + 2H2 → 2CH3CH2COOH + 2H2O (2.3)

Verifica-se que, em digestores em condições de desequilíbrio provocadas por sobrecargas orgânicas ou hidráulicas, a concentração de hidrogénio aumenta significativamente, acompanhada da acumulação de propionato (BARREDO E EVISON, 1991, RIEDEL E BRITZ, 1993). Recentemente INANC et al. (1996) apresentaram resultados que contrariaram a ideia estabelecida de que o propionato se acumulava como consequência da acumulação de hidrogénio, tendo concluído que a pressão parcial de hidrogénio não tinha efeito na acumulação de propionato. Segundo estes autores, a acumulação deste intermediário durante os períodos de instabilidade resulta de uma alteração da população acidogénica dominante.ZOETEMEYER et al. (1982) estudaram a acidificação da glucose num tanque agitado, em condições anaeróbias e concluíram que para determinadas concentrações de glucose se observava inibição pelos produtos (ácidos) formados. A razão entre a concentração de propionato e acetato foi proposta por MARCHAIM E KRAUSE (1993) como indicador da instabilidade em digestores anaeróbios.

As bactérias fermentativas têm tempos de duplicação curtos (MOSEY, 1983), verificando-se que a fermentação nunca é limitante no processo global da degradação anaeróbia (GUJER E

ZEHNDER, 1983).

2.1.2.3 Acetogénese

A etapa da acetogénese consiste na transformação dos produtos da fermentação em acetato, dióxido de carbono e hidrogénio por acção das chamadas bactérias sintróficas ou produtoras obrigatórias de hidrogénio (OHPA - obligate hydrogen producing acetogens). Em

condições normais estas transformações são termodinamicamente desfavoráveis (Tabela 2.1).

Tabela 2.1 Exemplo de algumas transformações acetogénicas (DOLFING, 1988).

∆G°

[kJ/reacção] CH3CH2CH2COO^- + 2H2O → 2CH3COO^- + 2 H2 + H

+

+48.1 (2.4) CH3CH2COO^- + 3H2O → CH3COO^- + 3 H2 + HCO3

+ H+ +74.0 (2.5)

CH3CH2OH + H2O → CH3COO^- + 2H2 + H

+

+ 9.6 (2.6)

No entanto, as condições normais não são as que prevalecem em digestores anaeróbios. Assim o valor actual de ∆G deve ser calculado em vez de ∆G°. No caso da degradação do propionato a acetato, ∆G obtém-se pela equação (2.7).

[ ]

    − ×     − ×     − + ∆ = ∆ COO 2 CH 3 CH 3 2 H 3 HCO COO 3 CH log RT 3 . 2 0 G G (2.7)

Considerando que as concentrações de propionato e acetato são iguais e que a concentração de bicarbonato é constante, o único factor variável é a concentração de hidrogénio (ZEHNDER E STUMM, 1988). Verifica que só se a concentração de hidrogénio fôr 10-4 atm ou menor, a oxidação do propionato se torna exergónica. Tal como para a degradação do propionato, as outras transformações acetogénicas produtoras de hidrogénio só são possíveis se a pressão parcial de hidrogénio no meio for da ordem de 10-4 atm.

Normalmente tal é assegurado pelas bactérias metanogénicas hidrogenotróficas ou, no caso de existir sulfato no meio, pelas bactérias sulfato-redutoras, por meio de um processo vulgarmente designado de “transferência de hidrogénio inter-espécies” (DOLFING, 1988). As bactérias metanogénicas, que têm uma elevada afinidade para o hidrogénio transformam-no juntamente com o dióxido de carbono, em metano, de acordo com a seguinte estequiometria (DOLFING, 1988):

A associação da reacção (2.8) com cada uma das transformações acetogénicas da Tabela 2.1 (equações (2.4) a (2.6)), permite torná-las termodinamicamente favoráveis. Seja, mais uma vez, o caso do propionato:

∆G°, (kJ/reacção)

(x4)CH₃CH₂COO^- + 3H₂O → CH₃COO^- + HCO₃^- + 3H₂ +H⁺ (x4) +74.0 (2.9) (x3)HCO3

+ 4H2 + H⁺→ CH4 + 3H2O (x3) -135 .6 (2.10) (total) 4 CH3CH2COO^- + 3H2O → 4CH3COO^- + HCO3

+ H⁺ + 3CH4 -102.4 (2.11)

Uma vez que a conversão de acetato a metano tem uma energia livre de Gibbs negativa, o balanço global da degradação do propionato a metano torna-se, deste modo, termodinamicamente favorável.

A degradação de propionato em digestores anaeróbios tem sido estudada extensivamente (THOLOZAN et al., 1988, MAWSON et al., 1991, LENS et al., 1996). Estes estudos demonstraram que além da oxidação sintrófica do propionato a H2 e acetato, podem ser obtidos outros produtos da degradação do propionato tais como álcoois e ácidos voláteis de cadeia mais longa, com 4 a 7 átomos de carbono (LENS et al., 1996). Em geral, estas reacções estão associadas com uma operação de digestores anaeróbios em condições sub-óptimas, mas não está esclarecido o seu papel na remoção da matéria orgânica.

Embora a existência das associações sintróficas dificulte o isolamento das bactérias produtoras de hidrogénio em cultura pura, BOONE E BRYANT (1980) identificaram

Syntrophobacter wolinii que degrada propionato a acetato, dióxido de carbono e hidrogénio, em

co-cultura com uma bactéria sulfato-redutora do género Desulfovibrio e MCINERNEY et al. (1981) demonstraram a conversão de butirato e outros ácidos até 8 átomos de carbono por

Syntrophomonas wolfei em co-cultura com bactérias metanogénicas hidrogenotróficas e

sulfato-redutoras.

Mais recentemente, STAMS et al. (1993) verificaram que, quando as bactérias metanogénicas de uma co-cultura sintrófica eram inibidas com a adição de bromoetanosulfonato (BES), o fumarato permitia substituir as bactérias metanogénicas como aceitador aparente de

electrões na degradação do propionato. A escolha do fumarato deveu-se a terem identificado que na degradação de propionato a acetato o passo energeticamente mais desfavorável era a conversão de succinato a fumarato. Observaram ainda que as bactérias que cresciam em fumarato eram obtidas numa cultura microscopicamente pura que degradava o propionato, quando era adicionado fumarato ou quando era adicionada uma cultura pura de Methanospirillum hungatii, que é uma bactéria methanogénica hidrogenotrófica.

As espécies sintróficas também estão envolvidas na β-oxidação dos ácidos gordos de cadeia longa. Syntrophomonas sapovorans foi a primeira espécie sintrófica identificada, capaz de oxidar ácidos gordos de cadeia longa com mais de 10 átomos de carbono (ROY et al., 1986).

ZINDER E KOCH (1984) identificaram a primeira cultura sintrófica termofílica, dependente da transferência de hidrogénio inter-espécies. Nesta cultura, que parece não ter paralelo em condições mesofìlicas, um organismo transforma acetato em hidrogénio e dióxido de carbono e outro organismo (bactéria metanogénica hidrogenotrófica) utiliza o hidrogénio para reduzir o dióxido de carbono a metano.

Pensa-se que as associações sintróficas requerem também uma associação física dos dois tipos de bactérias envolvidas. GUJER E ZEHNDER (1983), determinaram a distância máxima possível entre os dois tipos de bactérias para que a transferência do hidrogénio entre as duas espécies possa ocorrer e SCHINK E THAUER (1988) referiram que, de facto, a cooperação entre os dois grupos tróficos é optima quando a distância entre eles for mínima o que, segundo estes autores, pode justificar em parte o fenómeno da granulação. Talvez devido a este facto, num biofilme formado por uma população mista de bactérias anaeróbias mediu-se uma maior actividade em propionato e em butirato do que na mesma cultura não aderida a qualquer suporte (ALVES et al., 1997 c). DOLFING (1992) referiu que a existência de gradientes de hidrogénio entre as bactérias produtoras e as consumidoras deste intermediário tem consequências energéticas para os microorganismos envolvidos.

LI et al. (1994) fizeram uma revisão das várias associações sintróficas identificadas e documentadas até essa data.

2.1.2.4 Metanogénese

A metanogénese é a etapa final do processo, responsável directa pela produção de metano e constitui, em muitos casos, o passo controlante do processo (LAWRENCE, 1971). As bactérias metanogénicas pertencem ao reino das Arqueabactérias, sendo agrupadas actualmente em três ordens, 7 famílias e 21 géneros. Foram identificadas mais de 65 espécies (WOESE et al., 1990). Estas bactérias são anaeróbias estritas, requerendo para o seu desenvolvimento um potencial redox entre -250 e -300 mv. Possuem coenzimas e cofactores específicos (coenzima F420, F430, coenzima M, Metanopterina e Metanofurano (WOLFE, 1992)) e degradam apenas um número limitado de substratos com baixo número de carbonos: acetato, metanol, metilaminas, formato, e hidrogénio + dióxido de carbono. As equações 2.12 a 2.15 traduzem algumas das transformações que ocorrem nesta etapa:

4H2 + CO2→ CH4 + 2H2O (2.12)

CH3COO^- + H⁺→ CH4 + CO2 (2.13)

4HCOO^- + 4H⁺→ CH4 + 3CO2 + 2H2O (2.14)

4CH3OH → 3CH4+ CO2+ 2H2O (2.15)

No esquema da Figura 2.1 pode observar-se que, no processo de degradação anaeróbia, a maior parte do metano (70%) provém do acetato (JERIS E MCCARTY, 1965) pelo que esta conversão se reveste de particular importância. Acresce que as bactérias metanogénicas que degradam o acetato a metano representam o elo mais fraco de toda a cadeia de degradação anaeróbia no que respeita à sua resistência a condições adversa tais como choques orgânicos e hidráulicos e presença de substâncias tóxicas (COLLERAN, comunicação pessoal, 1996).

Nesta dissertação, as bactérias que degradam o acetato a metano segundo a reacção 2.13, serão designadas por acetoclásticas.

Até à data apenas foram identificados dois géneros como sendo acetoclásticos:

Methanosaeta (ex. Methanothrix) e Methanosarcina, sendo conhecidas pelo menos cinco espécies

acetoclásticas: Methanosarcina barkeri, Methanosarcina TM-1, Methanococcus mazei, Methanosarcina

morfologias muito distintas; Methanosaeta surge em filamentos podendo estes ser curtos e dispersos ou longos e agregados em feixes (KAMAGATA E MIKAMI, 1990) e Methanosarcina cresce em agregados de cocos. Em termos cinéticos Methanosaeta apresenta maior afinidade para o acetato (Ks=0.46 mM) do que Methanosarcina (Ks=3-5 mM), mas cresce mais lentamente que Methanosarcina (GUJER E ZENHDER, 1983). Por exemplo Methanosarcina barkeri e

Methanosarcina mazei têm tempos de duplicação de aproximadamente 24 horas enquanto que

a filamentosa Methanosaeta tem tempos de duplicação de 3.5 a 9 dias (HUSER et al., 1982). De entre os géneros de bactérias metanogénicas conhecidos, Methanosarcina é o mais versátil metabolicamente podendo utilizar H2/CO2, metanol, metilaminas, e acetato (MAH et

al., 1981), enquanto que o género Methanosaeta é exclusivamente acetotrófico (ZEHNDER et al., 1980; HUSER et al., 1982). Methanosarcina barkeri prefere metabolizar H2/CO2, metanol e trimetilaminas em vez de acetato e pode apresentar um crescimento diáuxico quando lhe são fornecidos vários substratos à escolha.

Segundo a classificação de BALCH et al., (1979), baseada na estrutura do RNA ribossómico 16S, existem vários géneros de bactérias metanogénicas que convertem hidrogénio e dióxido de carbono em metano: Methanobacterium, Methanobrevibacter, Methanothermus,

Methanococcus, Methanomicrobium, Methanogénium, Methanospirillum, Methanosarcina, Methanoplanus.

As bactérias hidrogenotróficas controlam o potencial redox do meio, mantendo a concentração de hidrogénio em níveis baixos, condicionando o processo de acetogénese. Algumas espécies, tais como Methanobacterium thermoautotrophicum ou Methanobrevibacter

arboriphilicus crescem apenas em H2/CO2 o que lhes confere características de autotróficas (COATES, 1991).

A metanogénese a partir do metanol está bem descrita (VOGELS et al., 1988, FLORÊNCIO et al., 1997). Em 1988 e segundo VOGELS et al. (1988) conheciam-se 11 espécies de bactérias metanogénicas que degradam o metanol, embora todos os estudos laboratoriais da metanogénese a partir do metanol tenham sido efectuados com Methanosarcina barkeri. O metanol pode ser convertido directamente em metano, mas também pode ser convertido em acetato pelas bactérias acetogénicas, se não houver limitação de carbono inorgânico, ou em H2/CO2. Esta transformação, embora termodinamicamente desfavorável pode ser possível por associação sintrófica com bactérias metanogénicas hidrogenotróficas (DISTEFANO

et al., 1992, FLORÊNCIO et al., 1997). Em digestores anaeróbios tenta-se maximizar a conversão directa de metanol a metano relativamente às transformações acetogénicas dado que a estas está associada uma menor remoção de carência química de oxigénio (CQO) (FLORÊNCIO et al., 1997).

O formato é utilizado por cerca de metade das espécies metanogénicas conhecidas. O crescimento em formato fornece aproximadamente a mesma quantidade de energia que o crescimento em H2/CO2 (VOGELS et al.,1988).

Existem várias revisões bibliográficas sobre a bioquímica, os aspectos energéticos e a microbiologia da metanogénese (DANIELS et al., 1984, KELTJENS E VAN DER DRIFT 1986, WOLFE, 1992, FERRY, 1992, JONES et al., 1987).

No documento MARIA MADALENA DOS SANTOS ALVES ESTUDO E CARACTERIZAÇÃO DE DIGESTORES ANAERÓBIOS DE LEITO FIXO (páginas 50-58)