A hifenação LC-DAD-SPE/NMR

Matrizes complexas como alimentos e extratos de produtos naturais contêm muitos compostos de diferentes classes químicas. Dessa forma, para realizar a identificação/caracterização dos metabólitos presentes nas amostras são necessárias etapas de extração, separação, purificação e isolamento.

Com o crescimento da instrumentação nas pesquisas, muitas análises da composição química de alimentos são realizadas através de técnicas cromatográficas como: líquida (HPLC, High Performance Liquid Chromatography) e gasosa (GC, Gas Chromatography) e, a extração por fase sólida (SPE, Solid Phase Extraction) acopladas aos detectores de espectrometria de massas (MS, Mass Spectroscopy) e de RMN, como nas técnicas hifenadas de LC-SPE-NMR, LC-MS, GC-MS, GC-SPE-MS e LC-SPE-NMR/MS.

O desenvolvimento da técnica hifenada LC-NMR (cromatografia liquida acoplada à ressonância magnética nuclear) iniciada no final dos anos 70 (WATANABE

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& NIKI, 1978; BAYER & KELLER, 1979) e a melhoria acelerada da eletrônica (hardwares e softwares) promoveram um imenso progresso no seu uso como uma importante ferramenta de isolamento e elucidação estrutural de compostos desconhecidos e, em pequena concentração em matrizes complexas.

A técnica LC-NMR possui vários modos de operação, que são escolhidos e desenvolvidos de acordo com o interesse da abordagem e considerando as características de cada amostra. São descritos o fluxo por meio contínuo (on-flow LC-NMR), com paradas na corrida cromatográfica (stopped-flow LC-NMR), com coletor de amostras (loop storage mode LC-NMR) e, com armazenamento em cartuchos de fase estacionária (SPE) que sem dúvida alguma é o mais utilizado (Figura 1.9).

FIGURA 1.9 – Esquema geral com os modos de operação da hifenação LC-UV-NMR.

Fonte: Figura adaptada de STURM & SEGER, 2012 e BRUKER, 2018.

O modo de operação por fluxo contínuo se baseia na utilização do espectrômetro de RMN de maneira semelhante ao detector UV em um cromatógrafo, pois a aquisição do experimento de ressonância (detecção) é realizada sem a interrupção da vazão da fase móvel cromatográfica. Esse método pode ser utilizado para uma rápida triagem em misturas complexas, mas apenas para compostos majoritários (BAYER & KELLER, 1979; ELIPE, 2003; EXARCHOU et al., 2005; GODEJOHANN & PREISS, 1997). No entanto, como as frações são analisadas pelo

on-flow stopped-flow Loop cassette Eluição SPE

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RMN em uma mistura de solventes e com concentração vindos da cromatografia são geradas algumas desvantagens como baixa sensibilidade na detecção e problemas com mudança dos solventes (BAYER & KELLER, 1979).

Já o modo stopped-flow consiste na interrupção da vazão quando a fração de interesse chega na cela de detecção do RMN, após a obtenção de espectros 1D e 2D o fluxo é liberado e, então repete o mesmo processo a cada fração seguinte (BAYER & KELLER, 1979; ELIPE, 2003; TODE et al., 2009). No entanto, a realização de diversas paradas gera desvantagens pois, diminui a eficiência da separação cromatográfica e, compostos muito concentrados podem causar efeito de memória na cela de detecção do RMN (BAYER & KELLER, 1979; EXARCHOU et al., 2005). Esses dois primeiros modos de operação são pouco usados pois apresentam uma grande desvantagem devido ao seu custo elevado pois são usados solventes deuterados na fase móvel da separação cromatográfica (BAYER & KELLER, 1979).

No modo de operação com coletor de amostras (loop storage) ocorre o armazenamento das frações de interesse em capilares para que posteriormente sejam realizados os experimentos de RMN. Uma limitação é que os analitos devam ser quimicamente estáveis no solvente durante o tempo de armazenamento no capilar e, período de aquisição dos experimentos de RMN 1D e 2D. Mas como esse é um fator de difícil controle, não é um método muito utilizado e pouco recomendado no estudo de matrizes desconhecidas (ELIPE, 2003; TSENG et al., 2000).

Na quarta modalidade de operação, com a retenção dos analitos em cartuchos do tipo SPE, o cromatógrafo realiza a separação dos constituintes químicos geralmente focando nos compostos de baixa concentração e, as frações de interesse são enviadas para uma unidade com cartuchos individuais de fase estacionária sólida. Essa técnica hifenada denominada LC-UV-SPE, concentra os analitos presente nas bandas cromatográficas através de diversas injeções (trapping) que promovem uma concentração do analito para posteriormente serem analisados no equipamento de RMN. Utilizando esse procedimento ocorre um expressivo aumento na concentração do soluto e, consequentemente na detecção, comerem um fator de 2 a 4 vezes quando comparado a técnica LC-NMR (EXAUCHOU et al., 2003; EXARCHOU et al., 2005).

O limite de detecção é uma grande limitação da técnica de LC-NMR. No entanto, o acoplamento com a espectrometria de massas (LC-NMR/MS) e o uso de acessórios, como cartuchos de SPE e sondas criogênicas, são alguns dos progressos que proporcionam um aumento significativo na sensibilidade das medidas de RMN

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permitindo a detecção de compostos em mistura na faixa de ppm (EXARCHOU et al., 2005; SILVA et al., 2013; SPRAUL et al., 2003; THOMASI et al., 2014).

A técnica de LC-NMR têm mostrado grande eficiência na separação e identificação de constituintes não alvo (non-target compounds) e com baixa concentração, principalmente em amostras complexas como fármacos, produtos naturais, amostras ambientais e em polímeros (EXARCHOU et al., 2005; THOMASI et al., 2014; CARDOZA et al., 2003; THOMASI et al., 2016; HILLER et al., 2013; SCHOLOTTERBECK & CECCARELLI, 2009; LOMMEN et al., 2000).

Em alimentos foram encontrados trabalhos com o isolamento e a identificação de sete (7) flavonoides (rutina, hiperina, isoquercitrina, reinoutrina, avicularina, quercitrina e floridzina) no extrato bruto de cascas de maçã por LC-NMR- MS (LOMMEN et al., 2000); nove (9) flavonoides glicosilados em tomates geneticamente modificados utilizando as técnicas de LC/NMR e LC/MS (LE GALL et al., 2003); cinco (5) flavonoides (taxifolin, aromadendrina, eriodictiolina, naringenina e apigenina), o ácido rosmarinico e o monoterpeno carvacrol em extrato de orégano grego (Origanum vulgare) por LC-UV-SPE-NMR-MS (EXARCHOU et al., 2003); vinte e cinco (25) compostos majoritários do azeite de oliva extra virgem por LC-DAD-SPE- NMR/MS (PÉREZ-TRUJILLO et al., 2010) e, compostos bioativos por LC-SPE- NMR/MS em um estudo com dezenove (19) tipos de algas marinhas comestíveis (LIU et al., 2016).