O eugenol possui potencial ação neuroprotetora no tratamento da DP, constituindo-se como um insumo biotecnológico para a profilaxia e/ou terapêutica da doença, tanto isoladamente, como quando associado à droga padrão (L-DOPA). Dessa forma, o presente estudo propõe a determinação dos efeitos, ainda não esclarecidos, do eugenol e da associação eugenol + L-DOPA sobre o modelo neurodegenerativo de DP induzido por 6-OHDA, através de análises neuroquímicas e neurocomportamentais.
4. OBJETIVOS
4.1 Objetivo geral:
Investigar o potencial neuroprotetor do eugenol, individualmente ou em associação ao L-DOPA, em modelo neurodegenerativo de Doença de Parkinson induzido por 6- hidroxidopamina.
4.2 Objetivos Específicos:
a) Induzir o modelo de Parkinson em ratos wistar através da administração intraestriatal de 6-OHDA;
b) Testar diferentes doses de administração do eugenol e seu efeito em associação ao L- DOPA;
c) Avaliar o comportamento motor através dos testes de Campo Aberto (Open Field Test), Rota-rod e Rotacional induzido por apomorfina;
d) Mensurar os níveis de nitrito/nitrato, peroxidação lipídica e glutationa reduzida em áreas cerebrais de interesse, a saber: córtex pré-frontal, hipocampo e corpos estriados ipsi e contralateral.
5. METODOLOGIA
5.1 Animais
Na presente pesquisa, foram utilizados ratos Wistar, machos, adultos com peso variando entre 250-300 g, provenientes do Biotério Setorial do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da UFC. Os animais foram acondicionados em caixas de polipropileno com no máximo 6 animais, à temperatura média de 24 ± 2°C em ciclos de alternância claro/escuro de 12 horas, recebendo ração padrão e água a ad libitum.
5.1.1 Aspectos éticos
Com relação aos aspectos éticos, os protocolos experimentais foram elaborados de acordo com o Guia para Cuidados e Uso de Animais de Laboratório da Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório (SBCAL) e aprovados pela comissão de Ética no Uso de Animais – CEUA, da Universidade Federal do Ceará – Campus Sobral, sob o protocolo de número 14/2016 (Anexo 1). Todos os esforços foram feitos para minimizar o número e o sofrimento dos animais utilizados.
5.2 Indução do modelo de Parkinson através da injeção unilateral intraestriatal de 6- OHDA.
Os animais foram divididos aleatoriamente em 7 grupos, com o n=6 por grupo. Posteriormente, os mesmos foram anestesiados com cetamina (100 mg / kg) e xilasina (10 mg / kg), administrados via intraperitoneal (i.p.). A cabeça do animal foi fixada em duas barras do aparelho estereotáxico (INSIGHT - figura 8) através do canal auditivo e os dentes incisivos fixados em uma barra de sustentação.
Logo após a adaptação do animal ao aparelho, realizou-se a assepsia com álcool 70% seguida de uma tricotomia. Após a incisão da pele, foi feita a remoção do periósteo, expondo a região do bregma. A partir deste, foram determinadas as coordenadas estereotáxicas (em milímetros), segundo o atlas de Paxinos e Watson (1986), para a realização de 3 orifícios: 1º: L: −2,5; AP: +0,5; V:+5,0; 2º: L:−3,0; AP: −0,5; V: +6,0; e 3º: L: −3,7; AP: −0,9; V: +6,5. Em seguida, com uma seringa de Hamilton de 5 μL, os animais receberam três injeções intraestriatal com 2 μL de 6-OHDA (21μg / animal) ou Salina (0,15M). Após a cautelosa injeção, a agulha
permaneceu no local por 2:30 min para permitir uma difusão completa da solução, que logo em seguida fora retirada e o corte suturado.
Figura 8. Procedimento estereotáxico de indução do modelo de hemiparkinsonismo através de
injeção unilateral intraestriatal de 6-hidroxidopamina (6-OHDA).
Fonte: FROTA, 2015.
5.3 Protocolo experimental
Os experimentos foram divididos em duas etapas, na primeira, decorrida 1 hora após o
término da cirurgia, os animais foram tratados com Eugenol (Sigma©) diluído em solução salina 0,15 mM com 1% de Etanol nas doses de 0,1, 1 e 10 mg / kg, a fim determinar qual a dose com melhor efiácia. Na segunda etapa, um dos grupos recebeu Prolopa®HBS Roche (L- DOPA + Benzerazida: 25 mg / kg e 6,25 mg / kg, respectivamente) como controle positivo, e foi avaliado o sinergismo entre os compostos [Eugenol (melhor dose observada) + L-DOPA/ Benzerazida a 12,5 mg / kg e 3,12 mg / kg, respectivamente]. Os tratamentos foram realizados diariamente durante 14 dias (Tabela 1). Dessa forma foi avaliada a ação neuroprotetora do eugenol e/ou sua associação com a droga padrão. Os controles (grupos Sham e 6-OHDA)
receberam solução salina 0,15 M com 1% de Etanol nas mesmas condições. No 15º dia, os animais foram devidamente eutanaseados utilizando guilhotina e tiveram suas áreas cerebrais (Córtex pré-frontal, corpos estriados ipsi e contralateral e hipocampo) dissecadas para posteriores análises neuroquímicas.
Tabela 1. Protocolo de tratamento experimental.
Fonte: Autor. Grupos Tratamento Dose (mg / kg) Via de administração Duração do tratamento (dias) 1- Falso operado (Sham) Solução salina 0,15 mM com 1% de Etanol - Controle - (controle -) - Oral 14 2 - Controle (6-OHDA) Solução salina 0,15 mM com 1% de Etanol - Controle (controle +) - Oral 14 3 - 6-OHDA + Eug 0,1 Eugenol (Sigma) diluído em solução salina 0,15 mM com 1% de Etanol 0,1 Oral 14 4 - 6-OHDA + Eug 1 Eugenol (Sigma) diluído em solução salina 0,15 mM com 1% de Etanol 1 Oral 14 5 – 6- OHDA + Eug 10 Eugenol (Sigma) diluído em solução salina 0,15 mM com 1% de Etanol 10 Oral 14 6 - 6-OHDA + Prolopa® L-DOPA/Benserazida (25 mg / kg e 6,25 mg / kg, respectivamente - Sigma©) 25 + 12,5 Oral 14 7 – 6-OHDA + Prolopa® + Eug 10 L-DOPA/Benserazida (12,5 mg / kg e 3,12 mg / kg) + Eugenol 10 mg / kg. - Oral 14
5.4 Análises Comportamentais
5.4.1 Teste do Campo Aberto (Open Field Test)
A metodologia utilizada neste teste foi descrita por Sielgel (1946) e validada por Archer (1973), sendo utilizada para avaliar a atividade exploratória do animal. No 14º dia, uma hora após a administração do Eugenol (0,1, 1 e 10 mg / kg; v.o.), os animais foram submetidos ao campo aberto (Figura 9), no qual foram avaliados os seguintes parâmetros comportamentais: atividade locomotora horizontal (número de cruzamentos nas linhas subdivizoras do equipamento), atividade locomotora vertical (número de vezes que o animal fica suspenso sobre as patas traseiras, também chamado de rearing), auto-limpeza (também definido como atividade de grooming) e o tempo em que o animal permaneceu parado, sem realizar qualquer dessas atividades.
Figura 9. Equipamento utilizado no teste de campo aberto (Open Field Test).
5.4.2 Teste do Rota-rod
Neste teste são avaliados os efeitos da administração da droga utilizada sobre a coordenação motora dos animais, bem como sua possível atividade como relaxante muscular (CARLINI; BURGOS, 1979).
Antes de serem submetidos ao teste, os animais foram treinados nos 8º, 10º e 12º dias de tratamento, após a administração cirúrgica de 6-OHDA. No período de treinamento foram utilizadas rotações de 5 a 10 rpm, durante 5 minutos, a fim de possibilitar a adaptação dos animais ao equipamento. No 14º dia, os animais foram então avaliados com rotação variando de 4 a 40 rpm, também durante 5 minutos. Os parâmetros avaliados no teste foram: a latência para a queda (medida em segundos), a velocidade da primeira queda (RPM), o número de quedas e o tempo de permanência sobre a barra giratória (DUNHAM; MIYA, 1957 com adaptações) (Figura 10).
Figura 10. Equipamento utilizado para o teste de Rota-rod.
5.4.3 Teste Rotacional induzido por Apomorfina
O modelo de indução unilateral do processo neurodegenerativo ocasionado por 6- OHDA ocasiona um desequilíbrio dopaminérgico entre os núcleos da base (contralateral e ipsilateral), culminando em um comportamento rotacional assimétrico. Dessa forma, pode-se avaliar o nível de degeneração neuronal baseando-se na rotação contralateral ao local lesionado pela neurotoxina. Para a realização do teste, foi administrado a apomorfina como agonista dopaminérgico, a qual induz um aumento temporário da atividade locomotora, possibilitando a quantificação do nível de lesão neuronal. No 14º, os animais receberam apomorfina (3 mg / kg; i.p.), e foram monitoradas as rotações, em torno do próprio eixo, no sentido contrário ao local da lesão (sentido contralateral). O número de rotações foi mensurado a cada 10 minutos, durante um período total de 60 minutos (KIM et al, 1998).
5.5 Análise da variação ponderal de massa corpória
Para avaliar possíveis alterações sistêmicas, realizou-se uma da análise da curva ponderal. Para isso, a massa corpórea dos animais foi medida (g) diariamente, desde o tempo zero (antes da cirurgia estereotáxica), até o 14º dia após a indução do modelo de DP. Os valores encontrados foram expressos como variação (∆) de massa corpórea (g), em relação à massa inicial.
5.6 Análises neuroquímicas
5.6.1 Dissecação das Áreas Cerebrais
Após a realização dos testes neurocomportamentais, os animais foram devidamente eutanasiados e, logo em seguida, os encéfalos foram retirados rapidamente e colocados sobre papel alumínio numa placa de Petri com gelo. Em seguida, o corpo estriado (caudado, putamen e globo pálido), o córtex pré-frontal e o hipocampo foram isolados das estruturas circunjacentes por divulsionamento com uma tesoura de microdissecação após o rebatimento lateral do córtex. Terminada a dissecação, cada área será colocada em papel de alumínio, sob gelo, pesada e armazenada a -80 °C para uso posterior. Os tecidos foram considerados como tendo a mesma viabilidade para experimentação até 24h após a dissecação.
5.6.2 Determinação da Concentração de Nitrito/Nitrato
Para a determinação da produção de nitrito/nitrato, primeiramente preparou-se uma curva padrão. Para isso, foram pesados 7 mg de NaNO2 e dissolvidos em 10 mL de água destilada (estoque-10 mM) e foram feitas diluições em série (10 e 20 x), ficando 1 mM, 100 M, 10 M, 5 M, 2,5 M, 1,25 M, 0,625 M, 0,312 M. Assim, foi realizada uma equação da reta para o cálculo das concentrações do teste (GREEN; TANNEMBAUN; GOLDMAN,1981). Para a determinação da concentração de nitrito em cada tecido, foram preparados homogenatos das áreas cerebrais a 10% (w/v) em solução de fosfato de sódio 150 mM, pH 7,4, após centrifugação (11000 g/15 min/4°C), os sobrenadantes foram coletados e a produção de óxido nítrico (NO) determinada através da reação de Griess (Figura 12).Uma alíquota de 100 μL do sobrenadante foi incubada com 100 μL do reagente de Griess [sulfanilamida 1 % em H3PO4 1 %/N-(-1-naphthyl)-ethylenediamine 0,1 %/ H3PO4 1 % / diluído em água (1:1:1:1)] a temperatura ambiente por 10 minutos. A absorbância foi, então, medida em espectrofotômetro a 540 nm. A concentração de nitrito (μM) foi determinada a partir de uma curva padrão de NaNO2. Os resultados foram expressos em μM/mg de tecido.
Figura 12. Representação da reação de Griess.
5.6.3 Determinação da Peroxidação Lipídica (TBARS)
O grau de lipoperoxidação em corpo estriado de ratos foi medido através da determinação das concentrações de substâncias reativas do ácido tiobarbitúrico (TBARS), conforme o método de Draper e Hadley (1990) (Figura 11). Foram preparados homogenatos das áreas cerebrais a 10% em solução de fosfato de sódio 150 mM, ph 7,4. Um volume de 0,25 mL do homogeneizado foi mantido em banho maria a 37 °C por 1 hora, seguido por precipitação com 400 μL de ácido perclórico (35%). Após centrifugação (14000 g/15 mim/4°C), o sobrenadante foi transferido e, a ele, adicionado 200 μL de solução de ácido tiobarbitúrico (1,2%). Após banho de água fervente (95-100 °C/30 min), o conteúdo de TBARS foi determinado em espectrofotômetro a 532 nm. Os resultados foram expressos em micromol de MDA por mg de tecido.
Figura 11. Representação da reação entre o ácido tiobarbitúrico com os produtos de
decomposição dos hidroperóxidos.
Fonte: Osawa; Felício; Gonçalves (2005).
5.6.4 Determinação da Concentração da Glutationa Reduzida (GSH)
Para a determinação da atividade antioxidante, fora determinada a concentração da GSH, a qual se baseia na reação do reagente de Ellman (5,5'-ditiobis; ácido 2-nitrobenzóico) (DTNB) com o tiol livre originando um dissulfeto misto mais ácido 2-nitro-5-tiobenzóico (Figura 13). A medida do produto de reação formado foi feita por leitura da absorbância a 412 nm. A concentração da glutationa reduzida fora expressa em nanograma de GSH / g de tecido, conforme metodologia descrita por Sedlak e Lindsay (1968).
Figura 13. Representação da reação entre a glutationa reduzida e o DNTB para a determinação
de hidroperóxidos empregando a enzima glutationa peroxidase.
Fonte: Rover Junior et al. (2001).
Para a determinação da concentração de GSH, foi construída uma curva padrão a partir da solução padrão de GSH (1 mg/mL), a qual foi preparada em triplicata de soluções a 6,25; 12,5; 25; 50 e 100 μg/mL. O branco foi feito com água destilada (4 mL) e a cada tubo das soluções de GSH foi acrescentado 4 mL de tampão Tris HCl 0,4M (pH 8,9). Para a determinação da equação da curva padrão de GSH, foi adicionado ainda a cada tubo 0,1 mL de DTNB (0,01 M) e, logo após, feita a leitura da absorbância a 412 nm.
Preparou-se o homogenato a 10% em EDTA 0,02 M, em seguida foi retirado 400 μL desse homogenato e adicionado 320 μL de água destilada e mais 80 μL de ácido tricloroacético a 50%. O material foi agitado e centrifugado (3000 g/15 min/4 °C). Em seguida foi recolhido 400 μL do sobrenadante e acrescido 800 μL de tampão Tris-HCl 0,4 M, pH 8,9 e mais 20 μL de DTNB 0,01 M. Após 1 minuto da reação foi feita a leitura da coloração em 412 nm, através de um espectrofotômetro. A concentração da glutationa reduzida foi expressa em nanograma de GSH por grama de tecido.
Todos os valores numéricos foram apresentados como média ± erro padrão da média (EPM) e submetidos a análises de diferenças estatísticas através da análise de variância (One-
way ou Two-way ANOVA), seguido pelo teste de Comparações Múltiplas de Bonferroni.
Consideraram-se os valores com P<0,05 como estatisticamente significativos. As análises estatísticas foram realizadas no programa GraphPad Prism, versão 7.0, (San Diego, CA, EUA).
6. RESULTADOS
6.1 Primeira etapa experimental – triagem da melhor dose do eugenol
6.2 Análises Comportamentais
6.2.1 Teste do Campo Aberto (Open field test)
No Teste do Campo Aberto, foram avaliados os parâmetros referentes à atividade exploratória expontânea dos animais. Observou-se que os ratos submetidos à neurotoxina (6- OHDA; 21 µg) apresentaram diminuição significativa da atividade locomotora, considerando os parâmetros analisados: diminuindo aproximadamente 36,7% (p<0,001) da atividade locomotora horizontal (53 ± 3,7 número de linhas cruzadas) e 35,7% (p<0,01) da vertical (14 ± 1,5 rearings); também observou-se um aumento significativo (p<0,001) no tempo parado (9,3 ± 1,8 segundos), bem como na frequência de autolimpeza em mais de 400 % (p<0,001) (12,88 ± 2,1 groomings), em relação ao grupo Sham (Salina, 0,9% + etanol 1% - controle negativo) (cruzamentos: 83,7 ± 6,2; rearings: 21,7 ± 0,9; tempo parado: 1,3 ± 0,7 s, groomings: 3,0 ± 1,8, respectivamente) (Figura 14).
Os grupos tratados com eugenol apresentaram contraponto dose-dependente aos efeitos causados pela neurotoxina nos parâmetros avaliados. Na atividade locomotora vertical os animais tratados com eugenol nas doses de 1 e 10 mg / kg apresentaram aumento significativo (p<0,001) de 42,4 % e 48,3 % (25,5 ± 1,38 e 27,3 ± 1,0 rearings), respectivamente, em relação ao grupo lesionado. O eugenol na dose de 0,1 mg / kg, no entanto, não apresentou efeito significativo neste parâmetro de observação. Por outro lado, todas as doses administradas foram capazes de reduzir significativamente a taxa de autolimpeza e o tempo em que os animais permaneceram parados. As doses de 0,1, 1 e 10 mg / kg reduziram em 54,7 % (5,8 ± 2,1
groomings), 79,3% (2,6 ± 1,3 groomings) e 96,7 % (0,41 ± 0,33 groomings), respectivamente,
em relação ao grupo lesionado. Adicionalmente, observou-se efeito semelhante em relação ao tempo parado, onde as doses de 0,1, 1 e 10 mg / kg apresentaram redução de 68 % (3,0 ± 1,7 s), 73,9 % (2,4 ± 0,8 s) e 88,3 % (1,1 ± 0,6 s), respectivamente, em relação ao grupo lesionado. Não houve, no entanto, diferença significativa na atividade locomotora horizontal, em relação ao grupo hemiparkinsoniano, do referido composto nas doses de 0,1 e 1 mg / kg. Contudo, pôde-se observar um aumento significativo (p<0,05) de 40,7% (74,6 ± 5,5 cruzamentos) no número de cruzamentos realizados pelos animais do grupo que recebeu eugenol a 10 mg / kg, aproximando-se dos valores observados no grupo Sham.
Figura 14. Análise da atividade exploratória expontânea através do teste de Campo Aberto.
Fonte: Autor. Legenda: Os ratos (n = 6 por grupo) foram submetidos à injeção intraestriatal com salina 0,9% (Sham - controle negativo), ou contendo a neurotoxina 6-OHDA (21 μg). Decorridas 1h após a injeção, os grupos foram tratados com eugenol (0,1, 1 e 10 mg / kg, v.o.) e os controles com Salina/1%Etanol. Após 14 dias, os animais foram submetidos ao teste de Campo Aberto, onde foram analisados os seguintes parâmetros: (A) Atividade locomotora horizontal, (B) Tempo de Imobilidade, (C) Atividade locomotora vertical (rearing) e (D) Autolimpeza (grooming). One-way ANOVA, Bonferroni. *, ** e *** indicam p<0,05, p<0,01 e p<0,001, respectivamente, em relação ao grupo Sham; #, ## e ### indicam p<0,05, p<0,01 e p<0,001, respectivamente, em relação ao grupo 6-OHDA. (b) indica p<0,01 em relação a Eug 0,1 mg / kg. Os dados estão expressos em média ± EPM. Programa utilizado: GraphPad Prism (v.7,0), considerando p<0,05 como significância estatística.
Para a avaliação dos danos motores causados pela neurotoxina 6-OHDA, foi realizado o teste de Rota-rod. Os parâmetros avaliados foram: latência para queda, velocidade da primeira queda, número de quedas e tempo de permanência na barra giratória.
Percebeu-se uma diminuição significativa no tempo de latência (p<0,01), na velocidade da primeita queda (p<0,01), bem como no tempo de permanência (p<0,05), nos animais que receberam a injeção intraestriatal de 6-OHDA (48 ± 4,7 segundos; 10,8 ± 0,6 RPM e 74,8 ± 4,9 segundos, respectivamente), em relação ao grupo Sham (88,2 ± 4,8 segundos; 14,63 ± 0,4 RPM e 114,1 ± 5,5 segundos, respectivamente). Além disso, estes também apresentaram um aumento (p<0,05) no número de quedas (5,2 ± 0,4 quedas) em relação ao controle negativo (3,8 ± 0,2 quedas) (Figura 15).
Os grupos tratados com eugenol nas doses de 1 mg / kg e 10 mg / kg, por sua vez, apresentaram um contraponto dose-dependente (p<0,05) aos danos motores causados pela referida neurotoxina em quase todos os parâmetros observados, com excessão do número de quedas, a saber: grupo 1 mg / kg: latência: 102 ± 8,3 s; velocidade da primeira queda: 16,5 ± 0,9 RPM; número de quedas: 3,6 ± 0,2 quedas; tempo de permanência: 127,3 ± 9,6 s; Grupo 10 mg / kg: latência: 116 ± 8,5 s; velocidade da primeira queda: 18 ± 1 RPM; 3,6 ± 0,2 quedas; tempo de permanência: 135,7 ± 8,6 s. O grupo tratado com eugenol a 0,1 mg / kg, no entanto, não apresentou efeito significativo em nenhum dos parâmetros observados.
Fonte: Autor. Legenda: Os ratos (n = 6 por grupo) foram submetidos à injeção intraestriatal com salina 0,9%
(Sham - controle negativo), ou contendo a neurotoxina 6-OHDA (21 μg). Decorridas 1h após a injeção, os grupos foram tratados com eugenol (0,1, 1 e 10 mg / kg, v.o.) e os controles com Salina/1%Etanol. Após 14 dias, os animais foram submetidos ao teste de Rota-rod, onde foram analisados os seguintes parâmetros: (A) Latência para a queda, (B) Velocidade da primeira queda, (C) Número de quedas e (D) Tempo de permanência. Os animais foram treinados três vezes antes da realização do teste. One-way ANOVA, Bonferroni. *, ** e *** indicam p<0,05, p<0,01 e p<0,001, respectivamente, em relação ao grupo Sham; #, ## e ### indicam p<0,05, p<0,01 e p<0,001, respectivamente, em relação ao grupo 6-OHDA. (a) e (b) indicam p<0,05 e p<0,01, respectivamente, em relação ao grupo Eug 0,1 mg /kg. Os dados estão expressos em média ± EPM. Programa utilizado: GraphPad Prism (v.7,0), considerando p<0,05 como significância estatística.
No 14º dia de tratamento, os animais foram submetidos ao teste rotacional induzido por um agonista dopaminérgico (apomorfina), a fim de quantificar o grau de neurodegeneração induzido pela neurotoxina (6-OHDA; 21 μg), através do número de rotações contralaterais ao local lesionado (Núcleo da base ipsilateral).
A avaliação do número de rotações em relação ao tempo, na qual o pico de rotações foi mensurado a cada 10 min durante uma hora, demonstrou um aumento significativo (p<0,001) dos animais hemiparkinsonianos, em todos os intervalos de tempo observados, em relação ao grupo Sham (Figura 16). A quantificação total desses valores, ademais, demonstrou um aumento (p<0,001) de mais de 8000 % no número de rotações contralaterais do grupo 6-OHDA (146,8 ± 30,2 rotações) em relação ao grupo Sham (1,8 ± 0,9 rotações) (Figura 17).
Os grupos tratados com eugenol (0,1, 1 e 10 mg / kg; v.o.), por outro lado, conseguiram reduzir o número de rotações contralaterais em todas as doses utilizadas, apresentando efeito dose-dependente, a saber: redução de 70,5 % (p<0,01) (43,2 ± 17,1 rotações), 79,4 % (p<0,01) (30,2 ± 21,5 rotações) e 88,7 % (p<0,001) (16,6 ± 8,9 rotações), respectivamente em relação ao grupo hemiparkinsoniano.
Fonte: Autor. Legenda: Os ratos (n = 6 por grupo) foram submetidos à injeção intraestriatal com salina 0,9%
(Sham - controle negativo), ou contendo a neurotoxina 6-OHDA (21 μg). Decorridas 1h após a injeção, os grupos foram tratados com eugenol (0,1, 1 e 10 mg / kg, v.o.) e os controles com Salina/1%Etanol. Após 14 dias, os animais foram submetidos ao teste rotacional induzido por apomorfina (3mg / kg; i.p.) sendo contabilizado o número de rotações contralaterais a cada 10 min durante 1h. Two-way ANOVA, Bonferroni. ** e *** indicam p<0,01 e p<0,001, respectivamente, em relação ao grupo Sham. Os dados estão expressos em média ± EPM. Programa utilizado: GraphPad Prism (v.7,0), considerando p<0,05 como significância estatística.
Fonte: Autor. Legenda: Os ratos (n = 6 por grupo) foram submetidos à injeção intraestriatal com salina 0,9%
(Sham - controle negativo), ou contendo a neurotoxina 6-OHDA (21 μg). Decorridas 1h após a injeção, os grupos foram tratados com eugenol (0,1, 1 e 10 mg / kg, v.o.) e os controles com Salina/1%Etanol. Após 14 dias, os animais foram submetidos ao teste rotacional induzido por apomorfina (3mg / kg; i.p.) sendo contabilizado o número de rotações contralaterais por 1h. One-way ANOVA, Bonferroni.*** indica p<0,001 em relação ao grupo Sham; ## e ### indicam p<0,01 e p<0,001, respectivamente, em relação ao grupo 6-OHDA. Os dados estão expressos em média ± EPM. Programa utilizado: GraphPad Prism (v.7,0), considerando p<0,05 como significância estatística.
A massa corpórea dos animais foi mensurada todos os dias durante os 14 dias de tratamento, a fim de observar uma possível variação no ganho de massa dos animais após a cirurgia esterotáxica (Figura 18). Observou-se que os animais que receberam apenas a neurotoxina (6-OHDA; 21μg) apresentaram uma diminuição significativa (p<0,001) na massa e maior dificuldade em recuperar a mesma durante os dias observados. Todavia, os animais tratados com eugenol apresentaram um aumento mais rápido, recuperando seu ganho de massa normal a partir do 5º (0,1 e 10 mg / kg) ou 6º (1 mg / kg) dia de tratamento. No entanto, apenas o grupo tratado com eugenol na dose de 10 mg / kg não apresentou diferença estatística significativa em relação ao grupo Sham.
Fonte: Autor. Legenda: Os ratos (n = 6 por grupo) foram submetidos à injeção intraestriatal com salina 0,9%
(Sham - controle negativo), ou contendo a neurotoxina 6-OHDA (21 μg). Decorridas 1h após a injeção, os grupos foram tratados com eugenol (0,1, 1 e 10 mg / kg, v.o.) e os controles com Salina/1%Etanol. Os animais foram pesados diariamente durante os 14 dias de tratamento. Two-Way ANOVA, Bonferroni. *, **, *** indicam p<0,05, p<0,01 e p<0,001, respectivamente, em relação ao grupo 6-OHDA; α indica semelhança estatística entre os grupos. Os dados estão expressos em média ± EPM. Programa utilizado: GraphPad Prism (v.7,0), considerando p<0,05 como significância estatística.
6.4 Análises Neuroquímicas
6.4.1 Mensuração dos níveis de Nitrito (NO2)/Nitrato (NO3) em áreas cerebrais
A análise neuroquímica demonstrou um aumento significativo (p<0,001) de mais de 200 % dos níveis de nitrito/nitrato, nos animais hemiparkinsonianos, em todas as áreas cerebrais analisadas, em relação ao grupo Sham (Figura 19). Os grupos tratados com eugenol (0,1, 1 e 10 mg / kg; v.o.), por sua vez, apresentaram efeito dose-dependente no hipocampo e no córtex pré- frontal, sendo que apenas as doses de 1 mg / kg e 10 mg / kg foram efetivas (p<0,001) em contrapor os efeitos oxidativos da produção de nitrito/nitrato nessas áreas. Todavia, apenas a dose de 10 mg / kg, conseguiu apresentar um efeito satisfatório nas regiões dos corpos estriados