I MUNOFLUORESCÊNCIA COM M ICROSCOPIA C ONFOCAL

3.5.1 PREPARAÇÃO DO MATERIAL E OBTENÇÃO DOS CORTES

Amostras de tecido miocárdico (CCC n=14; CNI n=8 e N n=6) foram colocadas em meio de inclusão O.C.T. (Tissue-Tek, Sakura, Finetechnical Co, Tokyo, Japan) e imediatamente mergulhadas em isopentano -70ºC e armazenadas a -80ºC até o processamento. Fragmentos de 5μm de espessura de cada amostra foram obtidos no Micrótomo criostato, colocados em lâminas silanizadas (Micro Slides, VWR Scientific, West Chester, PA) e fixados com acetona (Merck, Darmstadt, Alemanha) a 4°C por 10 minutos. Os cortes foram armazenados a -80ºC. As amostras de tecido miocárdico (CCC n=14; CNI n=8 e N n=6) também foram fixadas em formalina e inclusas em parafina pelo serviço de Anatomia e Patologia do InCor – HC/FMUSP, onde foram realizadas as análises histopatológicas pelo Dr. Luiz Benvenutti.

3.5.2 COLORAÇÃO HISTOLÓGICA

Para certificarmo-nos da qualidade e preservação do tecido, um fragmento de cada corte obtido em criostato foi submetido à coloração histológica por hematoxilina (Merck, Darmstadt, Alemanha) e eosina (Vetec Química Fina LTDA, Rio de Janeiro, BR). Os cortes foram submetidos a três banhos de água corrente por 5 minutos cada e corados com hematoxilina

durante 15 segundos. Em seguida, as lâminas foram submetidas a um banho de água corrente por 15 minutos e, então, corados com eosina durante 40 segundos. Posteriormente, foi realizada desidratação por passagens em uma seqüência de banhos em álcool (Synth, Merck, Darmstadt, Alemanha) 70%, 80%, 85% e três banhos com álcool 95%. Em seguida, foram realizados três passagens em xilol (Synth, Merck, Darmstadt, Alemanha) para diafanização, e finalmente, as lâminas foram montadas com

Entellan (Merck, Darmstadt, Alemanha).

3.5.3 REAÇÕES DE IMUNOFLUORESCÊNCIA

As imunofluorescências diretas para os marcadores CD3, CD4, CD8, CCR5, CXCR3, CCR4, CCL5/RANTES e CXCL9/Mig foram realizadas utilizando cortes com 5μm de espessura em lâminas silanizadas (Micro Slides, VWR Scientific, West Chester, PA). Os anticorpos e suas especificações estão mostrados na Tabela 3. Todos os anticorpos foram previamente titulados.

Tabela 3. Especificações dos anticorpos utilizados no ensaio de imunofluorescência com microscopia confocal

PE (Ficoeritrina); CI (controle de isotipo); N/C (anticorpos monoclonais não conjugados a fluorocromo); “ – ” (anticorpo secundário marcado com fluorocromo).

Anticorpos Fluorocromo Especificações/Isotipo Diluição

CD3 PE camundongo anti-humano IgG1 1:40

(Caltag, Burlingame, CA)

CD4 PE camundongo anti-humano IgG1 1:40

(Caltag, Burlingame, CA)

CD8 PE camundongo anti-humano IgG1 1:40

(Caltag, Burlingame, CA)

CCR5 PE camundongo anti-humano IgG1 1:40

(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)

CXCR3 PE camundongo anti-humano IgG1 1:40

(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)

CCR4 N/C camundongo anti-humano IgG1 1:40

(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)

CCL5/RANTES N/C camundongo anti-humano IgG1 1:40

(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)

CXCL9/Mig N/C camundongo anti-humano IgG1 1:40

(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)

CI PE camundongo anti-humano IgG1 1:40

(Pharmingen-BD, San Jose, CA)

Alexa 488 ⎯ cabra anti-camundongo IgG 1:200

(Molecular Probes, Eugene, OR)

Alexa 546 ⎯ cabra anti-camundongo IgG 1:200

(Molecular Probes, Eugene, OR)

Alexa 633 ⎯ cabra anti-camundongo IgG 1:200

As reações de imunofluorescência foram feitas com cortes armazenados a -80ºC, utilizando uma metodologia adaptada de Barbosa et al. (1999). Os cortes foram submetidos a uma seqüência de cinco banhos de três minutos em PBS (tampão salina fosfato). Para reduzir as marcações inespecíficas, os cortes foram incubados com PBS/BSA 2% (BSA, soro albumina bovina) durante 30 minutos. Em seguida, foram adicionados os anticorpos monoclonais diluídos em PBS/BSA 2%. Os cortes foram incubados por aproximadamente 15 horas a 4oC. Posteriormente, foram realizados cinco banhos de três minutos em PBS, e as lâminas foram secas. Foram adicionados, então, os anticorpos secundários, e nos casos em que os anticorpos primários que já apresentavam fluorocromo conjugado foram adicionados anticorpos secundários com o mesmo fluorocromo, amplificando assim a fluorescência. Após 45 minutos de incubação, foram realizados cinco banhos de três minutos, e secagem das lâminas. Posteriormente, os cortes foram incubados com DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride – SIGMA-Aldrich, Steinhein, Alemanha) 1:400 em PBS/BSA 2% durante 40 minutos e foi realizada uma nova etapa de cinco banhos de três minutos em PBS. As lâminas foram montadas com Hydromount (National Diagnostics, Atlanta, GA, U.S.A) e armazenadas a 4oC, protegidas da luz por, no máximo, 72 horas, até que fosse realizada a aquisição das imagens no Microscópio Confocal a laser Zeiss LSM 510 Meta/UV. Em lâminas separadas para cada paciente, foram realizados três tipos de controles negativos: a) cortes somente com DAPI, b) cortes incubados com anticorpos IgG não específicos marcados com FITC ou PE (controle de

isotipo - CTL) e com anticorpos secundários com o mesmo fluoróforo e c) cortes incubados somente com os anticorpos secundários, para descartar a marcação inespecífica. Fragmentos de tecido linfóide foram utilizados como controles positivos da reação, onde foram observadas células mononucleares positivas para os marcadores CD3, CD4, CD8, CCR5 e CXCR3 (Figura 5) e células positivas para CCR4, CXCL9/Mig e CXCL10/IP- 10 (Figura 6).

3.5.4 MICROSCOPIA CONFOCAL

As imagens foram obtidas por microscopia confocal (Bio-Rad MRC 1024 laser scanning confocal) utilizando o programa Lasersharp 3.0 acoplado a um Microscópio Confocal Zeiss LSM 510 Meta/UV, com objetiva de imersão em óleo (63X). O laser Enterprise (351 e 364nm), e os lasers Argônio (458, 477, 488, e 514 nm), Hélio-Neônio (543 nm) e Hélio-Neônio (633 nm) foram usados para excitar as preparações através das linhas de 363nm, 488nm, 546nm ou 633nm. A luz emitida foi selecionada utilizando filtros 522/35 para FITC ou DAPI; 598/40 para PE e 633 para Alexa633). Para visualizar as imagens de campo claro utilizamos os filtros 598/40 ou 633 dependo do filtro utilizado para a visualização do fluorocromo conjugado ao anticorpo utilizado.

Figura 5: Imagens representativas de análises de microscopia confocal para identificação de células CD3+, CD4+, CD8+, CCR5+ ou CXCR3+ em tecido linfóide. Cortes de tecido linfóide corados com anti-CD3(A1 e A2), anti-CD4(B1 e B2), anti-CD8(C1 e C2), anti-CCR5(D1 e D2), anti-CXCR3(E1 e E2) e anti-IgG não especifica (F1 e F2). Os fragmentos de tecido linfóide foram utilizados como controle positivo para titulação dos anticorpos. Os anticorpos monoclonais anti- CD3, anti-CD4, anti-CD8, anti-CCR5, anti-CXCR3 e anti-IgG são conjugados com PE e o sinal foi amplificado com o uso de anticorpos secundários conjugados com Alexa 546 (vermelho). Os cortes foram também corados com DAPI. Nas imagens de campo claro (A1, B1, C1, D1, E1 e F1) podemos visualizar o tecido e verificar se a marcação se encontra na célula ou no tecido adjacente; nas imagens de campo escuro (A2, B2, C2, D2, E2 e F2) são visualizadas apenas as células positivas para os marcadores (vermelho) e a coloração dos núcleos com DAPI (azul).

F1-CI

A1-CD3 B1-CD4 C1-CD8