Identificação das BAL

Após a caracterização microbiana dos isolados, dez bactérias foram selecionadas para serem identificadas com kit API 50 CHL utilizado para identificação de Lactobacillus e semelhantes, usando o software da companhia API LAB plus. A seleção das bactérias foi realizada considerando as diferentes características fenotípicas apresentadas e o número de células predominantes (109-108 UFC/ mL) destes isolados no grão conforme apresentado no Apêndice I. Foram então selecionadas seis bactérias do meio MRS e quatro do M17. A Tabela 9 apresenta o resultado da identificação das culturas selecionadas baseado no perfil bioquímico de 49 carboidratos (Figura 15). 0 10 20 30 40 50

bastonetes cocos leveduras

33 48 19 mi cro -orga nismos( % )

Tabela 9: Identificação das BAL pelo kit API 50 CHL

Nº do isolado Identificação % ID

1MRSK2 Leuconostoc mesenteroides ssp.

mesenteroides/dextranicum 2 99,0

2MRSK2 Lactococcus lactis ssp. lactis 1 89,2

1MRSK4 NI*

2MRSK4 Lactobacillus paracasei ssp. paracasei 3 69,4 3MRSK7 Lactobacillus paracasei ssp. paracasei 1 99,9 5MRSK7 NI*

2M17K3 Lactococcus lactis ssp. lactis 2 73,7

3M17K3 Lactococcus lactis ssp. lactis 2 95,5

4M17K5 Lactobacillus delbrueckii ssp. delbrueckii 96,5 3M17K9 Lactobacillus paracasei ssp. paracasei 1 99,9

NI – não identificado; ID- porcentagem de probabilidade de acerto na identificação

Figura 15: Perfil bioquímico apresentado por dois isolados por meio do kit API 50 CHL. Leitura do teste: viragem da cor púrpura a preto, para o teste da esculina, e viragem da cor púrpura a amarelo, para os demais, são considerados como resultados positivos.

Das dez bactérias identificadas pelo kit API, quatro foram identificadas como pertencentes ao gênero dos Lactobacillus, sendo três espécies ou sub-espécies diferentes; um Leuconostoc e três Lactococcus, sendo duas sub-espécies diferentes, resultando em seis espécies ou sub-espécies bacterianas. As outras duas bactérias não foram identificadas (Tabela 9).

Estes resultados foram posteriormente comparados com aqueles obtidos por métodos de identificação molecular. A técnica PCR ARDRA 16S-23S rDNA permitiu a identificação, no nível de espécie, apenas de duas bactérias isoladas do grão de kefir. Estas bactérias revelaram na visualização do gel da amplificação por PCR a presença de três bandas correspondentes aos espaçadores curto, médio e longo do rDNA 16S, sugerindo tratar-se de Lactobacillus (Figura 16). A análise das restrições por endonucleases específicas para identificação de BAL mostrou que os dois isolados eram uma única espécie de Lactobacillus casei, conforme ilustra a Figura 17.

Figura 16: Foto do gel de agarose 1,4% mostrando o resultado da amplificação PCR correspondente à região intergênica 16S-23S rDNA de amostras de bactérias isoladas do grão de kefir; possível observar-se a presença das três bandas correspondentes aos espaçadores.

Esta figura não apresenta a amplificação da bactéria de nº 6 devido ao não crescimento durante a ativação das culturas. Mas foi, posteriormente, submetida às mesmas etapas do processo de identificação.

Longo - - - + + + - - + -

Médio - - - + + + - - + -

Curto - - - + + + - - + -

Figura 17: Perfil de restrição dos espaçadores longo, médio e curto, amplificados, da região intergênica 16S-23S do rDNA de Lactobacillus casei, em gel de agarose 1,4%. PM: padrão de peso molecular 1Kb (Promega). +, ocorrência de digestão; -, ausência de digestão.

Foi realizado o seqüenciamento da região 16S do rDNA para as bactérias não identificadas pela PCR-ARDRA. Por esta metodologia, foram identificados quatro bactérias pertencentes ao gênero Lactococcus, sendo três Lactococcus lactis ssp.

lactis e um Lactococcus lactis ssp. cremoris, e duas espécies de Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides. Dois isolados ainda estão em processo de

Tabela 10: Identificação das BAL pelo Kit API 50 CHL e PCR -ARDRA 16S-23S rDNA ou seqüenciamento

Nº do

isolado UFC/mL Log

Identificação

API PCR- ARDRA 16S-23S rDNA _{ou sequenciamento} 1MRSK2 8,26 Leuconostoc mesenteroides ssp.

mesenteroides/ dextranicum 2

EA*

2MRSK2 9,18 Lactococcus lactis ssp. lactis 1 Lactococcus lactis ssp. lactis

1MRSK4 8,00 NI* Leuconostoc mesenteroides ssp.

mesenteroides 2MRSK4 9,23 Lactobacillus paracasei ssp.

paracasei 3

Lactococcus lactis ssp. lactis 3MRSK7 8,08 Lactobacillus paracasei ssp.

paracasei 1

Lactobacillus casei

5MRSK7 9,58 NI* EA*

2M17K3 8,28 Lactococcus lactis ssp. lactis 2 Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides

3M17K3 9,04 Lactococcus lactis ssp. lactis 2 Lactococcus lactis ssp. lactis 4M17K5 9,41 Lactobacillus delbrueckii ssp.

delbrueckii

Lactococcus lactis ssp. cremoris 3M17K9 7,78 Lactobacillus paracasei ssp.

paracasei 1

Lactobacillus casei

*NI – não identificado; EA – em andamento

O seqüenciamento de DNA confirmou os resultados dos dois Lactobacillus identificados por PCR-ARDRA 16S-23S rDNA, comprovando a eficácia da técnica ARDRA para determinação de espécies do gênero Lactobacillus conforme demonstraram MOREIRA et al. (2005), CRISPIM (2008) e SANTOS (2008).

Então, de acordo com os resultados dos métodos moleculares obtidos até agora, pode-se afirmar que entre os oito micro-organismos isolados e definitivamente identificados dos grãos de kefir, 2 foram identificados como Lactobacillus casei, 3 como Lactococcus lactis ssp. lactis, 1 como Lactococcus lactis ssp. cremoris e 2 como

Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides, totalizando em quatro espécies

diferentes (Tabela 10).

Como o objetivo da identificação dos micro-organismos no presente estudo consistia em denominar os componentes microbianos da cultura iniciadora formulada, este resultado não representa a microbiota total do grão de kefir e sim, parte dela, pois foram identificados apenas oito morfotipos bacterianos dentre os 22 isolados.

As duas bactérias identificadas como espécie L. casei pela técnica PCR-ARDRA 16S-23S rDNA foram as mesmas identificadas como L. paracasei pelo kit API (Tabela 10). Ambos os métodos bioquímico e molecular identificaram-nas como sendo do mesmo gênero, mas diferiram em relação à espécie identificada. Somente 29% dos resultados obtidos pelo kit API foram condizentes com os dados obtidos por métodos moleculares conforme mostra Tabela 10. Segundo CRISPIM (2008), alguns taxa gerados com base em características fenotípicas não correspondem às relações filogenéticas.

DE MARTINIS (2002) considerou insatisfatória a utilização do padrão de fermentação de carboidratos como único critério para identificação das bactérias acidoláticas (BAL) porque ocorrem frequentemente variações nas fermentações, e a interpretação pode ser subjetiva.

Diversos trabalhos da literatura apresentaram as linhagens Lactococcus lactis (ANGULO et al., 1993; PINTADO et al., 1996; MOTAGHI et al., 1997; GARROTE et al., 2001; SIMOVA et al., 2002; YÜKSEKDAG et al., 2004; WITTHUHN et al., 2005; ZHOU et al., 2007; MAGALHÃES et al., 2010) e Leuconostoc mesenteroides (MOTAGHI et al., 1997; GARROTE et al., 2001; WITTHUHN et al., 2005; ZHOU et al., 2007) como micro- organismos frequentemente isolados da população do grão de kefir, podendo ser considerados como espécies normais da microbiota dos grãos de kefir .

Segundo ANGULO et al. (1993), Lactococcus lactis ssp. lactis foi a espécie predominante entre as BAL, constituindo 62% da população do grão. Enquanto as espécies Streptococcus salivarius ssp. thermophilus e Leuconostoc spp. apareceram em somente três dos oitos grãos de kefir analisados. Diferentemente, GARROTE et al. (2001) isolaram a linhagem L. lactis ssp. lactis biovar diacetylactis em somente um tipo de grão.

SIMOVA et al. (2002) encontraram duas espécies de estreptococcos lácticos homofermentativos predominantes em todos os tipos de grãos e amostras de kefir analisados, sendo que a linhagem L. lactis ssp. lactis prevaleceu sobre o S.

thermophilus.

Diferentemente dos outros autores, YÜKSEKDAG et al. (2004) isolaram 11 linhagens de L. cremoris e apenas quatro linhagens de L. lactis em amostras de kefir de origem Turca.

Lactobacillus casei está entre as espécies de Lactobacillus homofermentativas

mais comumente isoladas dos grãos de kefir segundo BOSCH et al. (2006). Outros trabalhos também demonstraram a presença de L. casei (ANGULO et al., 1993;

MOTAGHI et al., 1997; SIMOVA et al., 2002; ZHOU et al., 2007), entretanto espécies de Lactobacillus heterofermentativas foram predominantes (ANGULO et al., 1993; MOTAGHI et al., 1997; SIMOVA et al., 2002) .

Todas as bactérias isoladas dos grãos neste estudo foram anteriormente identificadas em populações microbianas de grãos de kefir.