Identificação das cepas

3.2.1 Caracterização fisiológica das cepas

A partir do estoque mantido em meio skim milk (BD®) sob refrigeração,

as cepas foram semeadas em caldo BHI (BD®) e incubadas por 4h à

temperatura de 35ºC ± 2ºC em Termo-Shaker modelo Environ-shaker 3527

(Lab-Line Instruments, Melrose Park, EUA). Em seguida, o crescimento foi

semeado em ágar Nutriente (Oxoid, Basingstoke, Inglaterra) e incubado durante 18-24h à temperatura de 35ºC ± 2ºC. A partir deste crescimento recente, as cepas foram submetidas aos ensaios descritos abaixo.

3.2.1.1 Teste de oxidação-fermentação da glicose

O teste de oxidação-fermentação da glicose foi realizado em tubos com meio de cultura Hugh & Leifson (Merck, Alemanha), suplementado com glicose a 1% (Reagen, Emirados Árabes). As culturas foram repicadas com agulha bacteriológica, descartável e esterilizada, em um par de tubos contendo o meio de cultura, sendo adicionados 1 mL de óleo mineral esterilizado (Sigma, Saint

Louis, EUA) em apenas um dos tubos. Os tubos foram incubados a 35ºC ±2ºC

por 24 horas. A mudança da cor do meio, originalmente verde, para amarelo nos dois tubos foi indicativo de metabolismo fermentativo. Controle para

metabolismo fermentativo: ATCC7966 (Aeromonas hydrophila); Controle para

3.2.1.2 Produção de H2S, indol e motilidade

Uma colônia isolada foi inoculada com auxílio de uma agulha, previamente esterilizada, até a metade da coluna de meio SIM (Kasvi, Itália) contido em tubo e incubou-se por 24h em temperatura de 35ºC ±2ºC. Após esse período, foi realizada a leitura da mobilidade, ou seja, móvel se houve crescimento além da linha de inoculação, com turvação do meio, ou imóvel se foi observado crescimento somente no local de inoculação; produção de H2S através da formação de sulfeto de ferro insolúvel de cor negra (gás sulfídrico + citrato férrico amoniacal); produção de indol evidenciada pela adição de reativo de Kovacs (Newprov, Pinhais, Brasil). Controles positivos: Motilidade e indol: -E. coli ATCC25922, H2S – Proteus mirabilis ATCC7002; Controles negativos:

Motilidade - K. pneumoniae ATCC13883, Indol - P. mirabilis ATCC7002, H2S –

E. coli ATCC25922.

3.2.1.3 Fermentação da glicose, lactose, sacarose e sorbitol

Este teste foi realizado em tubos com meio de cultura para a fermentação de carboidratos (contendo indicador de Andrade), suplementado com glicose (Isofar, Rio de Janeiro, Brasil), lactose (VETEC, Rio de Janeiro, Brasil), sacarose (VETEC), e sorbitol (VETEC), na concentração de 1%. Um tubo de Durham invertido foi acrescentado aos tubos contendo glicose para possibilitar a verificação da produção de gás pela bactéria. Uma colônia isolada foi inoculada com o auxílio de uma agulha esterilizada e, após incubação à temperatura de 35ºC ±2ºC por 24h, o resultado positivo foi observado pelo aparecimento de uma coloração vermelho intensa no meio de

cultura. Controles positivos: glicose e lactose - E. coli, ATCC25922. Controles

negativos: glicose - P. aeruginosa ATCC27853, lactose - P. mirabilis

3.2.1.4 Produção da enzima urease

Uma colônia isolada foi inoculada com o auxílio de uma agulha esterilizada em caldo Uréia de Christensen (PROQUÍMICOS, Rio de Janeiro,

Brasil). Os tubos foram incubados a 35º C±2 ºC por 24h. A reação positiva foi

indicada pela mudança na coloração de meio amarelo para rosado como consequência da liberação de amônia a partir da uréia, e consequente

elevação do pH. Controle positivo: P. mirabilis - ATCC7002; Controle negativo:

E. coli – ATCC25922.

3.2.1.5 Utilização do citrato

Uma colônia isolada foi inoculada com o auxílio de uma agulha esterilizada no meio de cultura ágar Citrato de Simmons (Himedia, Mumbai, India), fazendo-se uma pequena estria no bisel, sem perfurar o ágar. Os tubos

foram incubados a 35º C± 2ºC por 24h. A produção de coloração azul indicou

a presença de produtos alcalinos e utilização do citrato de sódio como única fonte de carbono, indicando teste positivo. O teste negativo permaneceu na cor

original, verde. Controle positivo: K. pneumoniae ATCC13883; Controle

negativo: E coli ATCC25922.

3.2.1.6 Descarboxilação da lisina e ornitina e deidrolação da arginina

Os testes de descarboxilação da lisina e ornitina e deidrolação da arginina foram realizados em meio de cultura Möeller (Merck, Alemanha) acrescido do aminoácido correspondente na concentração de 1%. A cultura foi inoculada nos três tubos contendo cada aminoácido individualmente e em um quarto tubo contendo apenas a base de Möeller, isento de aminoácido, utilizado como controle. Em cada tubo foi colocado aproximadamente 0,5mL de

óleo mineral (Sigma), pois a reação ocorre em anaerobiose. Os tubos foram incubados por 24h a 35º ±2ºC. O meio inicialmente é de cor púrpura. As enzmas só são sintetizadas em pH ácido. O tubo controle de aspecto turvo e de cor amarela, demonstra que o microrganismo era viável e que o pH do meio acidificou. Nos tubos teste a mudança de cor de amarelo para púrpura é indicativo da descarboxilação ou deidrolação do aminoácido e alcalinização do

meio. Controle positivo para lisina: ATCC70063 (K. pneumoniae); Controle

negativo para lisina: ATCC15468 (A. caviae); Controle positivo para arginina:

ATCC7966 (A. hydrohila); Controle negativo para arginina: ATCC35624 (A.

veronii); Controle positivo para ornitina: ATCC35624 (A. veronii); Controle negativo para ornitina: ATCC7966 (A. hydrohila).

3.2.1.7 Utilização do malonato

O caldo malonato (Becton Dickinson/BD® Sparks Glencoe, EUA) é

utilizado na detecção de bactérias que utilizam omalonato como única fonte de carbono e o sulfato de amônio como única fonte de nitrogênio, produzindo hidróxido de sódio que alcaliniza o meio. Os tubos foram incubados a 35ºC±

2ºC por 24h. A viragem de cor verde para azul é indicativo da mudança de pH do meio (alcalino) visualizada através do indicador Azul de Bromotimol.

Controle positivo: K.pneumoniae ATCC13883; Controle negativo: E coli

ATCC25922.

3.2.1.8 Teste do Vermelho de Metila (VM) e Voges Proskauer (VP)

Uma colônia foi inoculada com ajuda de uma agulha esterilizada, em dois tubos com caldo dextrosado (Isofar, Rio de Janeiro, Brasil) e incubados a 35º C± 2ºC por 24h e 48h. Após incubação de 24h, adicionou-se 5 gotas do reagente Vermelho de Metila em um dos tubos. Para avaliar o VP, após 48h, adicionou-se 10 gotas do reagente Barrit I (alfa-naftol) e 5 gotas de Barrit II

(KOH). As bactérias VM positivas apresentaram acidificação do pH do meio (fermentação ácido mista), originando uma coloração vermelha intensa. As que são VP positivas, produzem acetoína como produto final, elevando o pH do meio até a neutralidade, que é evidenciada por sua oxidação à diacetil e reação com a peptona presente no meio, apresentando uma coloração vermelho

acastanhado na superfície do meio. Controle positivo para VM: E coli

ATCC25922. Controle positivo para VP: K.pneumoniae ATCC13883.

3.2.2 MALDI-TOF MS

A técnica de espectrometria de massa MALDI-TOF MS (Matrix Assisted

Laser Desorption/Ionization – Time of Flight Mass Spectometry) tem sido aplicada na identificação de microrganismos. Os ensaios foram realizados no

Laboratório Richet com o equipamento Bruker Daltonik MALDI Biotyper Flex

Series (Bruker, Bremen, Alemanha). A partir dos estoques em skim milk (BD®) as cepas foram semeadas em ágar nutriente (BD®) e incubadas por 24 horas em estufa bacteriológica a 35ºC±2ºC.

Uma colônia de cada estirpe foi selecionada e colocada na superfície da placa alvo de aço com 98 posições, cada cepa em uma posição de identificação. Em cada cepa colocamos 1µL de solução matriz de ácido benzóico e esperamos pela completa secagem. Em seguida, a placa foi levada para a câmara do equipamento no qual as cepas foram individualmente submetidas a pulsos de laser para vaporização do microrganismo e da solução matriz, permitindo a ionização de proteínas ribossomais. Um campo eletromagnético acelerou estas proteínas ribossomais ionizadas, que quando entraram no tubo de vácuo seguiram em direção ao detector e o tempo de voo de cada cepa foi registrado. A informação do tempo de voo (TOF) das proteínas ribossomais ionizadas é única para cada espécie e representa uma impressão digital do microrganismo. Através de um software estas informações do TOF podem ser confrontadas com um banco de dados contendo uma variedade de estirpes relevantes, fornecendo assim scores de

de 2.0 é interpretado como identificação satisfatória para o gênero e a espécie da cepa e scores entre 1.7 e 2.0 indicam que a identificação até gênero é segura.