Identificação das cepas

As cepas isoladas foram inicialmente avaliadas de acordo com a rotina laboratorial e identificadas através do sistema automatizado Vitek (bioMérieux, EUA), cartão YBC, de acordo com as recomendações do fabricante. Provas bioquímicas adicionais e estudo micromorfológico foram realizados conforme necessário.

As cepas de Rhodotorula, armazenadas no banco de cepas do Setor de Micologia em ágar infusão cérebro-coração (OXOID, EUA) contendo 20% de

glicerol, a -70 °C ou -20 °C, foram repicadas em ágar batata (OXOID, EUA) e CRHOMagar™ Candida (CRHOMagar Company, França) para verificação de pureza e viabilidade.

Os isolados viáveis e puros foram submetidos à reidentificação através do sistema manual de identificação de leveduras API 20C AUX (bioMérieux, EUA), além do sistema Vitek (bioMérieux, EUA). Os resultados discordantes entre as duas metodologias, Vitek e API 20C AUX, foram repetidos.

Todas as cepas também foram avaliadas quanto a aspectos macroscópicos da colônia, produção de urease, crescimento a 37 °C e ausência de pseudo-hifa e balistoconídio no estudo micromorfológico em ágar fubá (OXOID, EUA).

Paralelamente, todas as cepas foram enviadas ao Laboratório de Micologia do Instituto Adolfo Lutz para realização de prova convencional de assimilação de carboidratos e nitrato de acordo com Wickerham e Burton (1948). Os seguintes carboidratos foram avaliados: galactose, sacarose, maltose, celobiose, trealose, lactose, melibiose, melezitose, xilose, ramanose, eritritol, galactitol, inositol e peptona.

3.6.3. Teste de sensibilidade in vitro a drogas antifúngicas

O teste de sensibilidade aos antifúngicos foi realizado no Laboratório de Micologia do Instituto Adolfo Lutz, de acordo com as recomendações do National

Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS), documento M27-A2

(NCCLS, 2002) - considerado como método de referência - e também, segundo o documento E. Dis. 7.1 (EUCAST, 2002); ambos através do método de microdiluição em caldo.

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Drogas antifúngicas

As cepas de Rhodotorula foram avaliadas quanto ao perfil de sensibilidade frente às seguintes drogas antifúngicas: anfotericina B, fluconazol, itraconazol e voriconazol.

Os sais puros dos antifúngicos fluconazol e voriconazol (Pfizer INC, EUA), itraconazol (Janssen Pharmaceutica, EUA) e anfotericina B (Bristol-Myers Squibb, EUA), foram obtidos comercialmente ou através de doações dos respectivos laboratórios fabricantes.

Para preparo das solucões-mãe, as drogas foram diluídas em água (fluconazol) ou dimetil sulfóxido (anfotericina B, itraconazol e voriconazol) em concentrações 10 a 100 vezes maiores do que a maior concentração desejada para o teste final e armazenadas a -70 °C por um período máximo de 6 meses.

A concentração desejada da droga no preparo da solução-mãe foi obtida empregando-se a fórmula:

Volume (mL) = peso (mg) x potência do antifúngico (μg/mg) concentração desejada (μg/mg)

Preparação das placas de microdiluição

Microplacas de fundo plano, contendo 96 orifícios, previamente esterilizadas, foram preparadas para cada antifúngico de acordo com as recomendações adotadas (NCCLS, 2002). Uma solução de trabalho foi obtida a partir da solução-mãe (diluição 1:5), com diluições seriadas das drogas em meio de RPMI 1640 (Sigma,

EUA) estéril e tamponado com ácido morfolinepropanesulfônico (MOPS), preparadas de forma a alcançar uma concentração final 2 vezes maior que a concentração desejada para o teste de sensibilidade.

Alíquotas de 100 µl das concentrações finais obtidas foram dispensadas nos orifícios das colunas 2 a 11 das placas, de tal forma que a coluna dois contivesse a concentração mais alta do antifúngico e a 11, a mais baixa (Figura 3). Após a adição de 100 µl do inóculo (ver descrição abaixo) nos orifícios, foram obtidas as concentrações desejadas para cada antifúngico, com intervalos de: 64 µg/mL - 0,125 µg/mL para fluconazol e de 8 µg/mL - 0,016 µg/mL para itraconazol, voriconazol e anfotericina B.

As placas confeccionadas foram devidamente etiquetadas, seladas com película estéril, tampadas e armazenadas, por um período máximo de 6 meses, a temperatura de -70°C até o momento do uso. As placas contendo as soluções de anfotericina B foram embaladas com papel de alumínio, ao abrigo da luz.

B D F H A C E G 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 CC CE 64 32 16 8 4 2 1 0,5 0,25 0,125 8 4 2 1 0,5 0,25 0,12 0,06 0,03 0,016

FIGURA 3. Esquema de distribuição das soluções de antifúngicos em placas

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As colunas um e 12 não receberam diluições de antifúngicos, ficando reservadas para os controles de crescimento (CC) e esterilidade (CE), conforme descrição abaixo.

Preparação do Inóculo

O inóculo foi preparado de acordo com as recomendações do NCCLS, 2002. Resumidamente, as cepas disponíveis foram repicadas em ágar Sabouraud e incubadas por 24-48 horas a 35°C para garantir pureza e viabilidade. Aproximadamente cinco colônias, medindo cerca de 1 mm de diâmetro, foram ressuspendidas em 5 mL de solução salina estéril a 0,85%. A suspensão foi agitada vigorosamente e sua densidade ótica ajustada (por diluição) para o padrão 0,5 da escala de McFarland, determinada com a utilização de um turbidímetro (Hach Company, EUA). A concentração do inóculo assim preparado corresponde a 1-5 x 106 células de levedura por mL. A escala de MacFarland empregada foi obtida comercialmente (OXOID, EUA) e utilizada de acordo com as recomendações do fabricante.

A seguir, foi realizada uma diluição 1:50 seguida de outra diluição 1:20 em meio RPMI 1640 tamponado com MOPS, sem bicarbonato e com L-glutamina (Sigma, EUA), obtendo-se o inóculo desejado de 1-5 x 103 células por mL. Com a adição de 100 µl do inóculo de cada cepa aos orifícios de cada fileira (A - F) das colunas 2 a 11 das microplacas previamente preparadas - contendo diferentes concentrações do antifúngico a ser testado - as concentrações finais desejadas do inóculo (0,5 - 2.5 x 10³ UFC/mL) e do antifúngico foram obtidas. As fileiras G e H foram reservadas para as cepas padrão para o controle de qualidade.

O controle de crescimento (CC) foi verificado nos orifícios da coluna 12, nos quais 100 µL do inóculo foram adicionados a 100 µL de meio RPMI 1640 (Sigma, EUA), livre de antifúngico (Figura 3).

O controle de esterilidade (CE) do meio de cultura foi verificado em todos os orifícios da coluna 1, nos quais foram adicionados somente 200 µL de meio RPMI 1640 (Sigma, EUA), utilizado na preparação do inóculo, livre de antifúngicos e de leveduras ( Figura 3).

Modificações realizadas para adequação ao protocolo EUCAST

As principais modificações realizadas para adequação ao protocolo EUCAST (2002) em relação aos procedimentos descritos acima - segundo as recomendações do NCCLS (2002) - foram relacionadas ao meio de crescimento utilizado e ao preparo do inóculo. O meio de crescimento utilizado foi o RPMI 1640 (Sigma, EUA) tamponado com MOPS acrescido de 2% de glicose. Na preparação do inóculo, após ajuste inicial da densidade do mesmo para o padrão 0,5 na escala de MacFarland, realizou-se uma diluição 1:10 em meio de RPMI 1640 tamponado contendo 2% de glicose. Desta forma, a concentração final do inóculo preparado continha aproximadamente 1-5 x 105 células por mL, correspondendo a 100 vezes o inóculo obtido de acordo com o protocolo NCCLS (2002).

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Condições de incubação e leitura para determinação das concentrações inibitórias mínimas

As microplacas devidamente inoculadas foram incubadas a 35 °C, sem agitação e as concentrações inibitórias mínimas (MIC) foram determinadas por espectrofotometria a 530 nm (Titertek Multiskan, Suécia) utilizando-se os seguintes critérios: menor concentração de antifúngico que produziu 50% ou mais de inibição de crescimento, quando comparado ao poço controle, para fluconazol, itraconazol e voriconazol; e inibição de 90% para anfotericina B.

Para as cepas controle, as concentrações inibitórias mínimas foram determinadas após 24 horas de incubação (EUCAST, 2002), e após 24 e 48 horas de incubação (NCCLS, 2002).

Foram determinadas ainda as concentrações inibitórias mínimas nas quais 50% (MIC50) e 90% (MIC90) de todas as cepas testadas foram inibidas por cada

antifúngico após 72 horas de incubação. O valor modal (mais freqüentemente encontrado) e o intervalo de variação das concentrações inibitórias mínimas de cada antifúngico estudadoforam também determinados.

Controle de qualidade

O controle de qualidade foi garantido através da utilização das cepas-padrão recomendadas pelo NCCLS, Candida parapsilosis ATCC 22019 e Candida krusei ATCC 6258, inoculadas nas fileiras G e H de cada placa de microdiluição utilizada nos testes de sensibilidade aos antifúngicos.