Identificação de taninos

Os taninos representam compostos polifenólicos complexos heterogêneos e hidrossolúveis, de elevado peso molecular. De acordo com suas estruturas químicas, são divididos em dois grupos: taninos hidrolisáveis, formados por um poliol central

67 estereficado por unidades de ácido gálico (galotaninos) ou ácido hexahidroxidifênico (elagitaninos), e taninos condensados, formados através da condensação de unidades de catequinas ou leucocianidinas (MELO, SANTOS, 2006; CUNHA et al., 2008). Para a identificação de taninos foram empregados 3 testes de precipitação e um teste de reação colorimétrica no extrato bruto. Para os resultados dos testes de precipitação a reação com gelatina e a reação de acetato de chumbo apresentaram-se positivos, indicando a presença de taninos. Porém, os testes podem representar um falso positivo devido à presença de pseudotaninos na reação com gelatina; ou de outros metabólitos secundários na reação com acetato de chumbo. O teste de reação colorimétrica através da reação de sais de ferro também se apresentou positivo e obteve-se uma coloração azul indicando a presença de taninos hidrolisáveis. No entanto, outros compostos fenólicos presentes na solução do extrato podem interferir no resultado produzindo variações na cor exibida. Os resultados obtidos deste teste estão apresentados na Tabela 6 e sugerem a presença de taninos hidrolisáveis (galotaninos ou elagitaninos) ou de ácido gálico, ácido elágico ou seus derivados, devido à precipitação com gelatina e chumbo e especificamente à coloração azul característica para estas substâncias observadas no ensaio com o cloreto férrico.

Tabela 6. Resultados obtidos nos ensaios na identificação de taninos no extrato bruto de E. brasiliensis.

Amostra Reação Resultados

Extrato Bruto Reação com Gelatina

Reação com Sulfato de Quinina Reação com Acetato de Chumbo Reação de Sais de Ferro

+ -

+ + (cor azul)

+ Indica resultado positivo para o teste - Indica resultado negativo para o teste

Em alguns trabalhos relacionando a espécie de E. brasiliensis e o gênero Eugenia também foram identificados taninos, demonstrando entre os componentes majoritários o ácido gálico (ABE et al., 2012; SILVA et al., 2014; TEIXEIRA et al. 2015; INFANTE et al., 2016).

No trabalho com a V. macrocarpon de Pappas e Schaich (2009), em frutos e derivados da espécie também foram identificados taninos, em especial a classe de

68 catequinas. O ácido elágico representa 51% dos compostos fenólicos totais encontrados na V. macrocarpon, apresentando-se de forma livre, constituindo elagitaninos ou na forma de outros glicosídeos (NILE, PARK, 2014).

4.7. Cromatografia líquida de alta eficiência - CLAE

Análises feitas por CLAE-DAD permitem comparar, classificar, identificar e assim fornecer uma caracterização mais ampla do material vegetal. Em associação com uma técnica de separação e um detector eficiente, não é possível apenas quantificar, mas também obter dados que auxiliam na elucidação das estruturas de seus componentes.

Os extratos aquoso e etanólico foram submetidos à análise em modo gradiente para obter um perfil cromatográfico a fim de compará-los quanto a sua complexidade e componentes majoritários. Os cromatogramas apresentados correspondem às análises das frações n-butanólicas de ambos os extratos. Foram obtidos os espectros no UV para todos os cromatogramas dos extratos e padrões.

Os cromatogramas dos extratos aquoso (Figura 18 A) e etanólico (Figura 18 B) demonstraram semelhança dos seus perfis cromatográficos qualitativos (número de picos e tempos de retenção), apresentando um pico majoritário com tR= 41,7 min. A maior intensidade dos picos majoritários foi observada no comprimento de onde de 270 nm. Considerando-se os volumes de injeção utilizados de 35 μL para o extrato aquoso e de 20 μL para o extrato etanólico, bem como as áreas dos picos nos cromatogramas, é possível concluir que as substâncias correspondentes aos picos observados estão em maior concentração no extrato etanólico. Os espectros no UV/Vis dos picos principais do extrato aquoso e etanólico estão representados nas Figuras 19 e 20. Os espectros no UV/Vis dos picos correspondentes em termos de tR em ambos extratos foram idênticos.

69 Figura 18. Cromatogramas do extrato aquoso (A) e etanólico (B) de E. brasilisensis utilizando CLAE-DAD (270 nm). Condições de análise: fase móvel acetonirila (B) e água (A) adicionadas de ácido acético (1 %) em modo gradiente: 13- 68% B em 50 min, 100% B por 10 min; vazão de 1,0 mL/min; volume de injeção de 25 μL para o extrato etanólico e 35 μL para o extrato aquoso e detector de arranjo de diodos (DAD) com leitura de 270 nm.

A) Pico 20 Pico 21 Pico 3 Pico 3 Pico 5 Pico 11 Pico 6 Pico 10 B)

70 Figura 19. Espectros no UV/Vis dos picos do extrato aquoso referentes ao cromatograma da figura 18(A): 6 (A), 10 (B) e 20 (C).

A)

B)

71 Figura 20. Espectros no UV/Vis dos picos do extrato etanólico referentes ao cromatograma da figura 18 (B): 5 (A), 11 (B) e 21 (C).

Os espectros no UV/Vis das Figuras 19 e 20 apresentaram bandas na região de absorção de compostos fenólicos compreendidas entre cerca de 240 e 350 nm, possível observar nas Figuras 19 (B) e (C) e 20 (B) e (C) dos espectros de UV/Vis dos extratos aquoso e etanólico. Segundo Solovchenko (2011), flavonoides apresentam λmáx entre 240-285; alguns outros compostos fenólicos apresentam λmáx entre 250-280 nm e 300- 360 nm, como se pode observar nas Figuras 19 (A) e 20 (A); as posições exatas dos seus máximos variam conforme as classes de compostos. Flavan-3-ols, proantocianidinas e dihidrocalconas mostram uma absorção máxima principalmente entre 270-290 nm, enquanto que di-hidroflavonol além de apresentaras mesmas bandas

A)

B)

72 de absorção apresenta também uma pequena absorção à λmáx 320 nm (SANTOS– BUELGA et al., 2003; MARSTON, HOSTETTMAN, 2006).

Teixeira et al. (2015) identificou elagitaninos e flavonóides em variedades de E. brasiliensis utilizando CLAE-EM em fase reversa acoplado ao espectrofotômetro de massas. Foram encontrados nos frutos de variedade roxa de E. brasiliensis duas classes de flavonoides, entre elas cinco tipos de antocianinas e dois tipos de flavonóis, além de outros compostos fenólicos. Nos frutos de variedade amarela foram encontrados duas classes de flavonoides e dois derivados de ácido elágico foram detectados. As antocianinas, como esperado, foram encontrados apenas no fruto de variedade roxa, demonstrando diferença no perfil das duas variedades.

Flores et al. (2012) identificou nove antocianinas, dos quais cinco foram encontradas nos frutos de variedade roxa de E. brasiliensis . Adicionalmente, Silva et al. (2014) identificaram quatro tipos de antocianinas na mesma variedade, exibindo em seu trabalho uma forma adicional: cianidina 3-acetil-hexoside. Outros compostos também foram identificados nos frutos de variedade roxa como miricetina, rutina e kaempferol (REYNERTSON et al., 2008). Infante et al. (2016) também identificaram e quantificaram os compostos fenólicos encontrados em E. brasiliensis .

Considerando os trabalhos supracitados, apesar de o presente trabalho analisar extratos com misturas dos frutos contendo variedades roxa e amarela da espécie de E. brasiliensis, estes confirmam a diversidade de compostos encontrados na espécie vegetal. Conforme podemos observar no espetro do UV/Vis dos picos 3 de ambos os extratos um tipo de antocianina (Figura 23), já que foi observada banda com λmáx = 520 nm.

Os padrões quercetina, rutina, ácido gálico e ácido elágico foram utilizados para fins de identificação, porém nenhuma destas substâncias foi identificada nos extratos, o que foi confirmado através de co-injeções dos padrões com os extratos no cromatógrafo.

73 Figura 21. Espectros no UV/Vis dos picos 3 referentes aos cromatogramas dos extratos aquoso (A) e etanólico (B).