Identificação do componente majoritário do óleo de T minuta CN

Com a finalidade de se identificar e usar como padrão CG para identificar outros componentes, decidiu-se isolar o componente principal do óleo CN, conforme descrito na parte experimental (ítem 4.12). Desta maneira foi isolado o componente majoritário do óleo, com grau de pureza suficiente para ser analisado por RMN (Figura 44).

Figura 44. Perfil cromatográfico da fração 9 da coluna do óleo essencial das partes aéreas de T.

minuta CN , coletada em . A coluna utilizada é a DB5 de 25 m. Programa de análise: Tinicial= 50 °C,

Tfinal= 250 °C, rampa de 4 °C min-1.

O espectro de RMN de carbonos desta amostra (Figura 45) mostrou a presença de 10 carbonos de um monoterpeno. O esqueleto é composto de uma

carbonila (209,1 ppm), dois carbonos olefínicos, sendo um deles um metileno (112 ppm) e um metino (142 ppm). Demais carbonos, três metilas, um metínico e dois metilênicos, aparecem em campo alto, entre 53 e 9 ppm. O espectro de hidrogênios (Figura 46) mostra que duas metilas são equivalentes, e que absorvem em 0,90 ppm, com um J=6,8 Hz, caracterizando uma isopropila na estrutura e uma metila em 1,01 ppm, com J=6,7 Hz, ligada a um carbono da cadeia. Estes dados, juntamente com o dado de IK obtido do CG, corrobora com a estrutura da cetona conhecida como diidrotagetona (Figura 47).

Figura 45. Espectro de RMN de 13C a 400 MHz em CDCl3, do monoterpeno Diidrotagetona isolado de

Figura 46. Espectro de RMN de 1H a 400 MHz em CDCl3, do monoterpeno diidrotagetona.

5.3.2 Determinação das atividades biológicas in vitro dos óleos essenciais de T. minuta

5.3.3.1 Teste de Atividade Antioxidante pelo Método do radical livre DPPH

As amostras selecionadas para este teste foram os óleos das partes aéreas das três amostras de T. minuta. As amostras testadas não apresentaram atividade antioxidante.

5.3.3.2 Atividade antimicrobiana

Para este teste, foram utilizadas as amostras SN, FL e de diidrotagetona pura, componente prinipal da amostra CN. A amostra CN não foi testada porque não havia quantidade suficiente para o teste. Os resultados de CIM e CBM/CFM para os óleos de T. minuta são demonstrados na Tabela 18.

Tabela 18. Resultados de CIM, CBM e CFM para os óleos voláteis T. minuta.

Tag min. SN Tag FL Diidrotagetona Padrãoc

Carac Microorganismosa CIMb CBMb CIMb CBMb CIMd CBMd CIMb

Gram- positivos Staphylococcus aureus 1,25 >5 2,5 >10 0,1 >0,2 3,12 x10-3 Staphylococcus epidermidis 1,25 >5 2,5 10 0,2 >0,2 3,12 x10-3 Bacillus subtilis 2,5 >5 2,5 >10 - - 3,12 x10-3 Streptococcus pyogenes 2,5 >5 2,5 >10 0,1 >0,2 3,12 x10-3 Staphylococcus saprophyticus 2,5 >5 1,25 10 0,1 >0,2 3,12 x10-3 Gram- negativos Escherichia coli 2,5 >5 2,5 >10 0,2 >0,2 3,12 x10-3 Pseudomonas aeroginosa 2,5 >5 2,5 >10 0,1 >0,2 3,12 x10-3 Shiguella sonnei 2,5 >5 5 >10 0,1 >0,2 3,12 x10-3

Caract. Microorganismos CIMb CFMb CIMb CFMb CIMd CFMd CIMb

Fungos Candida albicans 0,62 0,62 1,25 5 0,1 0,2 6,25 x10-3

Candida tropicalis 1,25 1,25 5 >10 N/T - 6,25 x10-3 Cryptococcus neoformans 0,62 1,25 5 5 0,2 >0,2 10,3 x10-3 Sacharomyces cerivisae 0,62 1,25 1,25 >10 0,1 0,1 5,15 x10-3 a

ATCC (American Type Culture Collection); b em mg.mL-1; c Cloranfenicol para bactérias e nistatina para levedura; d: mg/mL. Tag min SN: Óleo das partes aéreas de T. minuta de Livramento solo sem nutrientes, Tag min FL: Óleo das partes aéreas de T. minuta de Florianópolis. DIidrotagetona: composto isolado de T. minuta .

Por se tratar de um composto isolado, a análise da atividade antimicrobiana da Diidrotagetona só é levada em conta para valores iguais ou inferiores a 0,1 mg/mL (DUARTE, 2004). Desta maneira, observando a Tabela 18 este composto apresentou atividade bacteriostática frente a maioria das cepas testadas e também apresentou moderada atividade fungicida frente a Sacharomyces cerivisae.

Estes resultados corroboram com as pesquisas de Hethelyi et al (1986), que determinaram a atividade de cinco componentes secundários da Tagetes minuta, dentre eles a diidrotagetona, que apresentou exelente atividade antimicrobiana frente a maioria das 40 cepas de bactérias e fungos e demostraram o potencial antifúngico e antibacteriano da o óleo essencial de Tagetes minuta e teve 100% de efeito inibitório sobre as bactérias e Gram positivas e 95 % de efeito inibitório sobre as bactérias Gram negativas e 100% de efeito inibitório sobre fungos.

Quanto aos OE, pode-se verificar na Tabela 18 que os dois apresentaram moderada atividade bacteriostática (valores de 0,5 a 1,6 mg/mL) frente apenas as bactérias do gênero Staphylococcus.

Destaque é dado a atividade fungicida do óleo SN, que foi efetivo frente a todos os fungos testados, principalmente frente a Cryptococcus neoformans, Sacharomyces cerivisae e Candida albicans (CIM= 0,62 mg/mL). No caso de Candida albicans, o CFM teve o mesmo valor de CIM, o que torna o óleo fungicida e fungiostático nesta quantidade. O óleo de Florianópolis apresentou uma diminuição da efetividade fungiostática e fungicida frente às mesmas cepas. As atividades realizadas neste trabalho frente a fungos e bactérias estão parciamente em concordância aos estudos de Hethelyi et al (1986) que demostraram o potencial antifúngico e antibacteriano do óleo essencial de Tagetes minuta com resultados de 100% efeito inibitório sobre as bactérias Gram positivas e 95 % de efeito inibitório sobre as bactérias Gram negativas e 100% de efeito inibitório sobre fungos.

O que diferencia o óleo coletado em Livramento em solos com menos nutrientes (SN) dos demais é a presença de E- tagetona (10%), piperitona (2%), óxido de piperitona (1,3%) e de óxido de cariofileno (5,4%), inexistentes nos demais óleos. Esta diferença parece ser determinante para a atividade antifúngica , uma vez que o referido óleo é mais ativo frente a fungos. Todos estes achados estão em concordância com trabalhos encontrados na literatura (SINGH, 1992). Além disso, a presença de 57,13 % de dihidrotagetona na composição do óleo SN também pode explicar a superioridade da atividade frente a fungos do mesmo quando comparado ao óleo FL.

5.4 Estudo dos óleos voláteis das amostras de Julocroton humilis

Família Euphorbiaceae

Esta espécie foi selecionada para este trabalho, por se observar que no local de coleta nenhum mamífero se alimenta da referida planta. Além disso, esta espécie possui apenas um trabalho científico sobre seus metabólitos fixos e nenhum a respeito de seus óleos essenciais.

Foram analisadas três amostras desta planta uma coletada em 2008 (Jh08) e reanalisada em 2010 (Jh08d) e outra amostra coletada em 2010 (Jh10).

5.4.1 Propriedades físicas e rendimentos dos óleos voláteis de Julocroton humilis As duas amostras frescas (Jh08 e Jh10) de óleos desta espécie apresentaram uma coloração vermelha intensa.

O rendimento médio para a extração do óleo volátil das partes aéreas de 2008 (Jh08) por hidrodestilação foi de 0,32%. A densidade (d) em g.mL-1 da amostra foi de 0,879 e o índice de refração (η) foi de 1,4936 enquanto o α [0,05; CH2Cl2] foi

de +21,7.

O rendimento médio para a extração do óleo volátil das partes aéreas de 2010 (Jh10) por hidrodestilação foi de 0,28%. A densidade (d) em g.mL-1 da amostra foi de 0,869 e o índice de refração (η) foi de 1,4934 enquanto o α [0,05; CH2Cl2] foi

de +27,3.

O óleo de 2008 também foi reavaliado após dois anos e dois meses de estocagem em refrigerador (com temperatura controlada de 4 a 10° C), sendo desta maneira renomeada Jh08d. Pôde-se constatar a mudança da coloração do óleo que passou a apresentar aspecto vermelho escuro a marrom, além de um aumento na sua viscosidade. A densidade (d) em g.mL-1 da amostra foi de 0,923 e o índice de refração (η) foi de 1,4976 enquanto o α [0,05; CH2Cl2] foi de +38,9.